Spiegazione dei termini di base della biologia molecolare
1. cDNA e cccDNA: il cDNA è un DNA a doppio filamento sintetizzato dalla trascrittasi inversa dall'mRNA;cccDNA è un DNA circolare chiuso a doppio filamento plasmidico libero dal cromosoma.
2. Unità di piegatura standard: l'unità di struttura secondaria della proteina α-elica e β-foglio può formare blocchi strutturali con disposizioni geometriche speciali attraverso vari polipeptidi di collegamento.Questo tipo di ripiegamento determinato è solitamente chiamato struttura super secondaria.Quasi tutte le strutture terziarie possono essere descritte da questi tipi pieghevoli, e anche dai loro tipi combinati, quindi sono anche chiamate unità pieghevoli standard.
3. CAP: proteina del recettore dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) CRP (proteina del recettore del cAMP), il complesso formato dopo la combinazione di cAMP e CRP è chiamato proteina attivante CAP (proteina attivata dal cAMP)
4. Sequenza palindromica: la sequenza complementare inversa di un segmento di un frammento di DNA, spesso un sito di enzimi di restrizione.
5. micRNA: RNA interferente complementare o RNA antisenso, che è complementare alla sequenza dell'mRNA e può inibire la traduzione dell'mRNA.
6. Ribozima: RNA con attività catalitica, che svolge un ruolo autocatalitico nel processo di splicing dell'RNA.
7. Motivo: ci sono alcune regioni locali con forma e topologia tridimensionali simili nella struttura spaziale delle molecole proteiche
8. Peptide segnale: un peptide con 15-36 residui amminoacidici all'N-terminale durante la sintesi proteica, che guida la transmembrana della proteina.
9. Attenuatore: una sequenza nucleotidica tra una regione operatore e un gene strutturale che termina la trascrizione.
10. Punto magico: quando i batteri crescono e incontrano una completa mancanza di aminoacidi, i batteri produrranno una risposta di emergenza per fermare l'espressione di tutti i geni.I segnali che generano questa risposta di emergenza sono il guanosina tetrafosfato (ppGpp) e il guanosina pentafosfato (pppGpp).Il ruolo di PpGpp e pppGpp non è solo uno o pochi operoni, ma ne influenza un gran numero, quindi sono chiamati super regolatori o punti magici.
11. Elemento promotore a monte: si riferisce alla sequenza di DNA che svolge un ruolo regolatore nell'attività del promotore, come TATA nella regione -10, TGACA nella regione -35, esaltatori e attenuatori.
12. Sonda di DNA: un segmento marcato di DNA con una sequenza nota, ampiamente utilizzato per rilevare sequenze sconosciute e schermare i geni bersaglio.
13. Sequenza SD: è la sequenza di legame del ribosoma e dell'mRNA, che regola la traduzione.
14. Anticorpo monoclonale: un anticorpo che agisce solo contro un singolo determinante antigenico.
15. Cosmide: è un vettore di DNA esogeno costruito artificialmente che conserva le regioni COS ad entrambe le estremità del fago ed è connesso al plasmide.
16. Screening spot blu-bianco: gene LacZ (codifica β-galattosidasi), l'enzima può decomporre il substrato cromogenico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolo-β-D-galattoside) per produrre blu, rendendo così il ceppo blu.Quando viene inserito il DNA esogeno, il gene LacZ non può essere espresso e il ceppo è bianco, in modo da schermare i batteri ricombinanti.Questo è chiamato screening bianco-blu.
17. Elemento ad azione cis: una specifica sequenza di basi nel DNA che regola l'espressione genica.
18. Enzima di Klenow: grande frammento di DNA polimerasi I, tranne per il fatto che l'attività esonucleasica 5' 3' viene rimossa dall'oloenzima della DNA polimerasi I
19. PCR ancorata: utilizzata per amplificare il DNA di interesse con una sequenza nota a un'estremità.Una coda poli-dG è stata aggiunta a un'estremità della sequenza sconosciuta, quindi il poli-dC e la sequenza nota sono stati utilizzati come primer per l'amplificazione PCR.
20. Proteina di fusione: il gene della proteina eucariotica è collegato al gene esogeno e la proteina composta dalla traduzione della proteina genica originale e della proteina esogena è espressa contemporaneamente.
Altri termini di biologia molecolare
1. La mappa fisica del DNA è l'ordine in cui sono disposti i frammenti (digeriti dall'endonucleasi di restrizione) della molecola di DNA.
2. La scissione di RNase è divisa in due tipi (autocatalisi) e (eterocatalisi).
3. Ci sono tre fattori di inizio nei procarioti: (IF-1), (IF-2) e (IF-3).
4. Le proteine transmembrana richiedono una guida (peptidi segnale) e il ruolo degli chaperoni proteici è (aiuta a ripiegare la catena peptidica nella conformazione nativa della proteina).
5. Gli elementi nei promotori possono generalmente essere suddivisi in due tipi: (elementi del promotore principale) e (elementi del promotore a monte).
6. Il contenuto della ricerca della biologia molecolare comprende principalmente tre parti: (biologia molecolare strutturale), (espressione e regolazione genica) e (tecnologia di ricombinazione del DNA).
7. I due esperimenti chiave che dimostrano che il DNA è il materiale genetico sono (infezione da pneumococco nei topi) e (infezione da fago T2 di Escherichia coli).potenziale).
8. Esistono due differenze principali tra hnRNA e mRNA: (l'hnRNA viene unito nel processo di conversione in mRNA), (l'estremità 5' dell'mRNA viene aggiunta con un cappuccio m7pGppp e vi è una poliadenilazione extra all'estremità 3' della coda acida dell'mRNA (poliA)).
9. I vantaggi della forma multi-subunità della proteina sono (la subunità è un metodo economico per l'utilizzo del DNA), (può ridurre l'impatto di errori casuali nella sintesi proteica sull'attività proteica), (l'attività può essere molto efficiente e rapidamente si aprono e si chiudono).
10. Il contenuto principale della prima teoria della nucleazione del meccanismo di ripiegamento delle proteine include (nucleazione), (arricchimento strutturale), (riarrangiamento finale).
11. Il galattosio ha un duplice effetto sui batteri;da un lato (può essere utilizzato come fonte di carbonio per la crescita cellulare);dall'altro (è anche un componente della parete cellulare).Pertanto, è necessario un promotore S2 indipendente da cAMP-CRP per la sintesi permanente a livello di fondo;allo stesso tempo, è necessario un promotore S1 dipendente da cAMP-CRP per regolare la sintesi di alto livello.La trascrizione inizia da ( S2 ) con G e da ( S1 ) senza G.
12. La tecnologia del DNA ricombinante è nota anche come (clonazione genica) o (clonazione molecolare).L'obiettivo finale è (trasferire l'informazione genetica del DNA in un organismo in un altro organismo).Un tipico esperimento di ricombinazione del DNA di solito include i seguenti passaggi: (1) Estrarre il gene bersaglio (o gene esogeno) dell'organismo donatore e collegarlo enzimaticamente a un'altra molecola di DNA (vettore di clonazione) per formare una nuova molecola di DNA ricombinante.② La molecola di DNA ricombinante viene trasferita nella cellula ricevente e replicata nella cellula ricevente.Questo processo si chiama trasformazione.③ Esaminare e identificare le cellule riceventi che hanno assorbito il DNA ricombinante.④Coltivare le cellule contenenti DNA ricombinante in grandi quantità per rilevare se il gene dell'aiuto estero è espresso.
13. Esistono due tipi di replicazione del plasmide: quelli che sono strettamente controllati dalla sintesi proteica della cellula ospite sono chiamati (plasmidi stretti) e quelli che non sono strettamente controllati dalla sintesi proteica della cellula ospite sono chiamati (plasmidi rilassati).
14. Il sistema di reazione PCR dovrebbe avere le seguenti condizioni: a.Primer di DNA (circa 20 basi) con sequenze complementari a ciascuna estremità dei due filamenti del gene bersaglio da separare.B.Enzimi con stabilità termica come: TagDNA polimerasi.c, dNTPd, sequenza di DNA di interesse come modello
15. Il processo di reazione di base della PCR comprende tre fasi: (denaturazione), (ricottura) e (estensione).
16. Il processo di base degli animali transgenici di solito include: ①Introduzione di un gene estraneo clonato nel nucleo di un ovulo fecondato o di una cellula staminale embrionale;②Trapianto dell'ovulo fecondato inoculato o della cellula staminale embrionale nell'utero femminile;③Sviluppo e crescita embrionale completo Per la prole con geni estranei;④ Utilizzare questi animali che possono produrre proteine estranee come riproduttori per allevare nuove linee omozigoti.
17. Le linee cellulari di ibridoma sono generate ibridando cellule (milza B) con cellule (mieloma) e poiché (cellule spleniche) possono utilizzare l'ipoxantina e (cellule ossee) fornire funzioni di divisione cellulare, possono essere coltivate in terreno HAT.crescere.
18. Con l'approfondimento della ricerca, viene chiamata la prima generazione di anticorpi (anticorpi policlonali), la seconda generazione (anticorpi monoclonali) e la terza generazione (anticorpi di ingegneria genetica).
19. Attualmente, l'ingegneria genetica dei virus degli insetti si concentra principalmente sul baculovirus, che si manifesta nell'introduzione di (gene della tossina esogena);(geni che interrompono il normale ciclo di vita degli insetti);(modifica dei geni del virus).
20. I fattori proteici trans-attivi corrispondenti agli elementi comuni TATA, GC e CAAT nel promotore dell'RNA polimerasi II dei mammiferi sono (TFIID), (SP-1) e (CTF/NF1), rispettivamente.
ventuno.I fattori di trascrizione di base dell'RNA polimerasi Ⅱ sono, TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, e la loro sequenza di legame è: (D, A, B, E).In cui la funzione di TFII-D è (associazione a TATA box).
ventidue.La maggior parte dei fattori di trascrizione che si legano al DNA funzionano sotto forma di dimeri.I domini funzionali dei fattori di trascrizione che si legano al DNA sono comunemente i seguenti (elica-gira-elica), (motivo del dito di zinco), (basico-leucina) motivo della cerniera).
ventitré.Esistono tre tipi di modalità di scissione dell'endonucleasi di restrizione: (taglio sul lato 5' dell'asse di simmetria per generare estremità adesive da 5'), (taglio sul lato 3' dell'asse di simmetria per generare estremità appiccicose da 3' (taglio sull'asse di simmetria per generare segmenti piatti)).
ventiquattro.Il DNA plasmidico ha tre diverse configurazioni: (configurazione SC), (configurazione oc), (configurazione L).Il primo in elettroforesi è (configurazione SC).
25. Sistemi di espressione genica esogena, principalmente (Escherichia coli), (Lievito), (Insetto) e (Tabella di cellule di mammifero).
26. I metodi comunemente usati per gli animali transgenici sono: (metodo di infezione retrovirale), (metodo di microiniezione di DNA), (metodo di cellule staminali embrionali).
Applicazione Biologia molecolare
1. Nomina le funzioni di più di 5 RNA?
RNA di trasferimento tRNA Amminoacido di trasferimento Ribosoma RNA rRNA Il ribosoma costituisce l'RNA messaggero mRNA Modello di sintesi proteica RNA nucleare eterogeneo hnRNA Precursore dell'mRNA maturo Piccolo RNA nucleare snRNA Coinvolto nello splicing dell'hnRNA Piccolo RNA citoplasmatico Proteina scRNA/7SL-RNA Riconoscimento del segnale sintetizzato e localizzato nel plasma Componenti corporei di riconoscimento del segnale sintetizzato e localizzato nel reticolo plasmatico RNA antisenso anRNA/micRNA Regola l'espressione genica Ribozima RNA Enzimaticamente RNA attivo
2. Qual è la principale differenza tra promotori procarioti ed eucarioti?
TTGACA procariotico --- TATAAT------Sito di inizio-35 -10 Potenziatore eucariotico---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Sito di inizio-110 -70 -25
3. Quali sono gli aspetti principali della costruzione artificiale di plasmidi naturali?
I plasmidi naturali hanno spesso difetti, quindi non sono adatti per l'uso come vettori per l'ingegneria genetica, e devono essere modificati e costruiti: a.Aggiungi geni marcatori di selezione adatti, come due o più, che sono facili da usare per la selezione, solitamente geni antibiotici.B.Aumentare o diminuire i siti di taglio enzimatico adatti per facilitare la ricombinazione.C.Accorcia la lunghezza, taglia i frammenti non necessari, migliora l'efficienza di importazione e aumenta la capacità di carico.D.Cambia il replicone, da tight a loose, da poche copie a più copie.e.Aggiungi elementi genetici speciali secondo i requisiti speciali dell'ingegneria genetica
4. Fornisci un esempio di un metodo per lo screening differenziale del cDNA tessuto-specifico?
Vengono preparate due popolazioni cellulari, il gene bersaglio è espresso o altamente espresso in una delle cellule e il gene bersaglio non è espresso o è poco espresso nell'altra cellula, quindi il gene bersaglio viene trovato mediante ibridazione e confronto.Ad esempio, durante l'insorgenza e lo sviluppo dei tumori, le cellule tumorali presenteranno mRNA con livelli di espressione diversi rispetto alle cellule normali.Pertanto, i geni correlati al tumore possono essere eliminati mediante ibridazione differenziale.Il metodo di induzione può anche essere utilizzato per schermare i geni la cui espressione è indotta.
5. Generazione e screening di linee cellulari di ibridomi?
Le cellule B della milza + le cellule del mieloma, aggiungono glicole polietilenico (PEG) per promuovere la fusione cellulare e le cellule di fusione del mieloma B splenico cresciute nel mezzo HAT (contenente ipoxantina, aminopterina, T) continuano ad espandersi e nutrirsi.La fusione cellulare contiene: cellule di fusione milza-milza: incapaci di crescere, le cellule della milza non possono essere coltivate in vitro.Cellule di fusione osso-osso: non possono utilizzare l'ipoxantina, ma possono sintetizzare la purina attraverso la seconda via utilizzando la folato reduttasi.L'aminopterina inibisce la folato reduttasi e quindi non può crescere.Cellule di fusione osso-milza: possono crescere in HAT, le cellule della milza possono utilizzare l'ipoxantina e le cellule ossee forniscono la funzione di divisione cellulare.
6. Qual è il principio e il metodo per determinare la struttura primaria del DNA mediante il metodo di terminazione terminale dideossi (metodo Sanger)?
Il principio è usare un terminatore di catena nucleotidica - 2,,3,-dideossinucleotide per terminare l'estensione del DNA.Poiché manca il 3-OH necessario per la formazione di legami 3/5/fosfodiestere, una volta incorporato nella catena del DNA, la catena del DNA non può essere ulteriormente estesa.Secondo il principio dell'accoppiamento di basi, ogni volta che la DNA polimerasi necessita di dNMP per partecipare alla catena del DNA normalmente estesa, ci sono due possibilità, una è partecipare al ddNTP, che si traduce nella terminazione dell'estensione della catena del deossinucleotide;l'altro è partecipare a dNTP, in modo che la catena del DNA possa ancora continuare ad estendersi fino a quando non viene incorporato il ddNTP successivo.Secondo questo metodo, è possibile ottenere un gruppo di frammenti di DNA di diverse lunghezze che terminano con ddNTP.Il metodo consiste nel suddividere in quattro gruppi rispettivamente ddAMP, ddGMP, ddCMP e ddTMP.Dopo la reazione, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide può leggere la sequenza del DNA secondo le bande di nuoto.
7. Qual è l'effetto di regolazione positiva della proteina attivatrice (CAP) sulla trascrizione?
Proteina del recettore dell'adenilato ciclico (cAMP) CRP (cAMP receptor protein), il complesso formato dalla combinazione di cAMP e CRP è chiamato CAP (cAMPactivated protein).Quando E. coli viene coltivato in un terreno privo di glucosio, la sintesi di CAP aumenta e la CAP ha la funzione di attivare promotori come il lattosio (Lac).Alcuni promotori dipendenti da CRP mancano della tipica caratteristica di sequenza della regione -35 (TTGACA) che hanno i promotori comuni.Pertanto, è difficile per l'RNA polimerasi legarsi ad essa.La presenza di CAP (funzione): può migliorare significativamente la costante legante dell'enzima e del promotore.Mostra principalmente i seguenti due aspetti: ① CAP aiuta la molecola dell'enzima ad orientarsi correttamente modificando la conformazione del promotore e l'interazione con l'enzima, in modo da combinarsi con la regione -10 e svolgere il ruolo di sostituire la funzione della regione -35.②CAP può anche inibire il legame dell'RNA polimerasi ad altri siti nel DNA, aumentando così la probabilità di legarsi al suo specifico promotore.
8. Quali passaggi sono solitamente inclusi in un tipico esperimento di ricombinazione del DNA?
UN.Estrarre il gene bersaglio (o gene esogeno) dell'organismo donatore e collegarlo enzimaticamente a un'altra molecola di DNA (vettore di clonazione) per formare una nuova molecola di DNA ricombinante.B.Trasferire la molecola di DNA ricombinante nella cellula ricevente e replicarla e conservarla nella cellula ricevente.Questo processo si chiama trasformazione.C.Eseguire lo screening e identificare le cellule riceventi che hanno assorbito il DNA ricombinante.D.Coltura di massa delle cellule contenenti il DNA ricombinante per rilevare se il gene dell'aiuto estero è espresso.
9. Costruzione della libreria genica Vengono forniti tre metodi per lo screening dei ricombinanti e viene brevemente descritto il processo.
Screening della resistenza agli antibiotici, inattivazione inserzionale della resistenza, screening delle macchie blu-bianche o PCR, screening differenziale, sonda del DNA La maggior parte dei vettori di clonazione trasporta geni di resistenza agli antibiotici (anti-ampicillina, tetraciclina).Quando il plasmide viene trasferito in Escherichia coli, i batteri acquisiranno resistenza e quelli senza trasferimento non avranno resistenza.Ma non può distinguere se è stato riorganizzato o no.In un vettore contenente due geni di resistenza, se un frammento di DNA estraneo viene inserito in uno dei geni e provoca l'inattivazione del gene, è possibile utilizzare due controlli di piastra contenenti farmaci diversi per lo screening dei ricombinanti positivi.Ad esempio, il plasmide pUC contiene il gene LacZ (che codifica per la β-galattosidasi), che può decomporre il substrato cromogenico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolo-β-D-galattoside) per produrre il blu, trasformando così il ceppo in blu.Quando viene inserito il DNA estraneo, il gene LacZ non può essere espresso e il ceppo è bianco, in modo da schermare i batteri ricombinanti.
10. Spiegare il processo di base per ottenere animali transgenici attraverso cellule staminali embrionali?
Le cellule staminali embrionali (ES) sono cellule embrionali durante lo sviluppo embrionale, che possono essere coltivate e proliferate artificialmente e hanno la funzione di differenziarsi in altri tipi di cellule.Coltura di cellule ES: la massa cellulare interna della blastocisti viene isolata e coltivata.Quando l'ES viene coltivato in uno strato privo di alimentatore, si differenzierà in varie cellule funzionali come le cellule muscolari e le cellule N.Se coltivato in un terreno contenente fibroblasti, ES manterrà la funzione di differenziazione.L'ES può essere manipolato geneticamente e la sua funzione di differenziazione può essere integrata senza influire sulla sua funzione di differenziazione, il che risolve il problema dell'integrazione casuale.Introdurre geni esogeni nelle cellule staminali embrionali, quindi impiantarli nell'utero di topi femmine gravide, svilupparli in cuccioli e incrociarli per ottenere topi omozigoti.
