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La PCR diretta è una reazione che utilizza direttamente tessuti animali o vegetali per l'amplificazione senza estrazione di acido nucleico.In molti modi, la PCR diretta funziona come la normale PCR

La differenza principale è il tampone personalizzato utilizzato nella PCR diretta, il campione può essere sottoposto direttamente alla reazione PCR senza estrazione dell'acido nucleico, ma esistono requisiti corrispondenti per la tolleranza degli enzimi e la compatibilità del tampone coinvolto nella reazione PCR diretta.

Sebbene ci siano più o meno inibitori della PCR nei campioni comuni, la PCR diretta può ancora ottenere un'amplificazione affidabile sotto l'azione di enzimi e tamponi.La reazione PCR tradizionale richiede un acido nucleico di alta qualità come modello, che può inibire il regolare svolgimento della reazione PCR se il modello contiene proteine ​​e altre impurità.La PCR diretta è attualmente una delle tecnologie più diffuse nel campo della diagnostica molecolare.

01 Direct PCR è stato originariamente utilizzato per animali e piante

La prima applicazione della PCR diretta è nel campo degli animali e delle piante, come il sangue, i tessuti e i capelli di ratto, gatto, pollo, coniglio, pecora, bovino, ecc., foglie e semi di piante, ecc., utilizzati per studiare la genotipizzazione, il transgenico, il rilevamento del plasmide, l'analisi del gene knockout, l'identificazione della fonte del DNA, l'identificazione delle specie, l'analisi SNP e altri campi.

Questi campi hanno alcune caratteristiche comuni, ovvero il contenuto del gene bersaglio è relativamente alto e l'estrazione dell'acido nucleico è problematica, quindi la PCR diretta può non solo far risparmiare tempo e avere un piccolo impatto sui risultati, ma anche risparmiare sui costi.

La PCR diretta utilizzata per il rilevamento dei patogeni è una questione degli ultimi anni, alcuni produttori di reagenti per PCR hanno compiuto molti sforzi in questa direzione durante l'innovazione.Soprattutto in questa epidemia di COVID-19, molti di questi prodotti di rilevamento sono apparsi sul mercato, come il SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) ricercato e sviluppato da Foregene, che utilizza la tecnologia Real-time RT PCR (rRT-PCR) per il rilevamento qualitativo degli acidi nucleici SARS-CoV-2 in campioni di tamponi nasofaringei o orofaringei umani.

Foregene è una delle aziende che utilizza la tecnologia Direct PCR, per il rilevamento dei normali ORF1ab, N, E evariante linee di acidi nucleici in campioni di tamponi rinofaringei o orofaringei umani come il lignaggio SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), il lignaggio B.1.351 (ZA), il lignaggio B.1.617 (IND) e il lignaggio P.1 (BR).

02  Reagenti necessari per la PCR diretta

Campione lisato

Il lisato del campione può essere configurato da solo o acquistato.La differenza nella composizione di diverse marche di lisato renderà diversa la capacità di lisi, e quindi il tempo di lisi sarà leggermente diverso.Ad esempio, per la preparazione di campioni di tessuto animale, si consiglia generalmente una lisi di 30 minuti o durante la notte e la soluzione di lisi per i virus varia da 3 a 10 minuti.

Mix master per PCR

Si consiglia di utilizzare la DNA polimerasi hot-start per migliorare l'amplificazione specifica e aumentare la capacità di amplificazione.Il nucleo della PCR diretta è una polimerasi altamente tollerante.

Eliminare o inibire i componenti nel campione che influenzano l'amplificazione del DNA

Dopo che il campione è stato elaborato con il lisato, verranno rilasciati proteine, lipidi e altri detriti cellulari, queste sostanze inibiranno la reazione PCR.Pertanto, la PCR diretta richiede l'aggiunta di rimozione o inibitori corrispondenti per ridurre l'influenza di questi fattori.

03  Una raccolta di cinque punti di conoscenza della PCR diretta

Innanzitutto, la tecnologia Direct PCR è una tecnologia PCR diretta per vari campioni biologici.In questa condizione tecnica, non è necessario separare ed estrarre l'acido nucleico, utilizzare direttamente il campione di tessuto come oggetto e aggiungere i primer del gene target per eseguire la reazione PCR.

In secondo luogo, la tecnologia Direct PCR non è solo una tradizionale tecnologia di amplificazione del modello di DNA, ma include anche la PCR di trascrizione inversa del modello di RNA.

In terzo luogo, la tecnologia Direct PCR non solo esegue direttamente reazioni PCR qualitative di routine su campioni di tessuto, ma include anche reazioni qPCR in tempo reale, che richiedono che il sistema di reazione abbia una forte capacità di interferenza della fluorescenza anti-fondo e che la fluorescenza endogena estingua l'abilità antagonista.

In quarto luogo, i campioni presi di mira dalla tecnologia Direct PCR necessitano solo del rilascio di stampi di acido nucleico e non rimuovono proteine, polisaccaridi, ioni salini, ecc. che interferiscono con la reazione PCR.Ciò richiede che la polimerasi dell'acido nucleico e la miscela PCR nel sistema di reazione abbiano un'eccellente resistenza e adattabilità per garantire l'attività enzimatica e l'accuratezza della replicazione in condizioni complesse.

In quinto luogo, il campione di tessuto preso di mira dalla tecnologia Direct PCR senza alcun trattamento di arricchimento dell'acido nucleico e la quantità di stampo è molto piccola, il che richiede che il sistema di reazione abbia una sensibilità e un'efficienza di amplificazione estremamente elevate.


Orario di pubblicazione: 28 giugno 2021