COVID-19 è una malattia infettiva causata dalla sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus di tipo 2. Quando una persona è infetta, i sintomi più comuni includono febbre, tosse e mancanza di respiro.

I campioni utilizzati per il test possono essere raccolti mediante tamponi nasofaringei o tamponi orofaringei.

Cos'è la PCR?

Il metodo standard di rilevamento del coronavirus è la reazione a catena della polimerasi, PCR.Questo è un metodo ampiamente utilizzato in biologia molecolare.Può copiare rapidamente da milioni a miliardi di frammenti di DNA specifici.

Il nuovo coronavirus contiene un genoma di RNA a filamento singolo molto lungo.Per rilevare questi virus mediante PCR, le molecole di RNA devono essere convertite nelle loro sequenze di DNA complementari mediante trascrittasi inversa, quindi il DNA appena sintetizzato può essere amplificato mediante procedure PCR standard, comunemente note come RT-PCR.

Processo RT-PCR

Estrazione dell'RNA

Per eseguire questo metodo, l'RNA virale dovrebbe essere sostanzialmente estratto.È possibile utilizzare una varietà di kit di purificazione dell'RNA per una separazione comoda, rapida ed efficace.

Per estrarre l'RNA virale utilizzando un kit commerciale, aggiungere prima il campione a una provetta per microcentrifuga e quindi mescolarlo con il tampone di lisi.Questo tampone è altamente denaturato e di solito è costituito da fenolo e isotiocianato di guanidina.Inoltre, gli inibitori dell'RNasi sono generalmente presenti nel tampone di lisi per garantire l'isolamento dell'RNA virale intatto.

Dopo aver aggiunto il tampone di lisi, vortexare il tubo di miscelazione a impulsi e incubare a temperatura ambiente.Il virus viene quindi lisato in condizioni altamente denaturanti fornite dal tampone di lisi.

Dopo che il campione è stato lisato, viene utilizzata una provetta da centrifuga per la procedura di purificazione.Il campione viene caricato nella provetta da centrifuga e quindi centrifugato.

Questa procedura è un metodo di estrazione in fase solida in cui la fase stazionaria è costituita da una matrice di gel di silice.

In condizioni ottimali di sale e pH, le molecole di RNA si legano alla membrana di silice.

Allo stesso tempo, le proteine ​​e altri contaminanti vengono rimossi.

Dopo la centrifugazione, inserire la provetta da centrifuga in una provetta di raccolta pulita, eliminare il filtrato e quindi aggiungere il tampone di lavaggio.

Posizionare nuovamente la provetta nella centrifuga per forzare il tampone di lavaggio attraverso la membrana.Questo rimuoverà tutte le impurità rimanenti dalla membrana, lasciando solo l'RNA legato al gel di silice.

Dopo aver lavato il campione, inserire la provetta in una provetta da microcentrifuga pulita e aggiungere il tampone di eluizione.

Viene quindi centrifugato per forzare il tampone di eluizione attraverso la membrana.Il tampone di eluizione rimuove l'RNA virale dalla colonnina e ottiene RNA purificato privo di proteine, inibitori e altri contaminanti.

PASSO 2

Concentrato misto

Dopo aver estratto l'RNA virale, il passaggio successivo consiste nel preparare la miscela di reazione per l'amplificazione mediante PCR.In questa fase viene utilizzato il concentrato.Questa soluzione concentrata è una soluzione concentrata premiscelata costituita da una premiscela, trascrittasi inversa, nucleotidi, primer diretto, primer inverso, sonda TaqMan e DNA polimerasi.

Infine, per completare questa miscela di reazione, viene aggiunto il modello di RNA.Le provette vengono miscelate mediante vortex a impulsi, quindi la miscela di reazione viene caricata nella piastra PCR.La piastra per PCR di solito contiene 96 pozzetti e può analizzare più campioni contemporaneamente.

PASSO 3

Amplificazione PCR

Successivamente, posizionare la piastra nella macchina PCR, che è essenzialmente un termociclatore.

La RT-PCR in tempo reale viene utilizzata per rilevare il nuovo coronavirus del 2019 amplificando la sequenza bersaglio nel gene RdrRP, nel gene E e nel gene N.La scelta del gene bersaglio dipende dalla sequenza del primer e della sonda.

Il primo passaggio della RT-PCR è la trascrizione inversa.Viene sintetizzato il primo filamento di DNA complementare, che viene avviato dal primer inverso della PCR, che si lega alla parte complementare del genoma dell'RNA virale.Quindi la trascrittasi inversa aggiunge nucleotidi di DNA all'estremità 3′ del primer per sintetizzare il DNA complementare all'RNA virale.La temperatura e la durata di questo passaggio dipendono dai primer, dall'RNA target e dalla trascrittasi inversa utilizzati.

Successivamente, viene applicata una fase iniziale di denaturazione, che si traduce nella denaturazione dell'ibrido RNA-DNA.Questo passaggio è necessario per attivare la DNA polimerasi.Allo stesso tempo, la trascrittasi inversa viene inattivata.

La PCR consiste in una serie di cicli termici.Ogni ciclo è costituito da fasi di denaturazione, ricottura ed estensione.

La fase di denaturazione comporta il riscaldamento della camera di reazione a 95 gradi Celsius e il suo utilizzo per la denaturazione del modello di DNA a doppio filamento.

Nella fase successiva, la temperatura di reazione viene ridotta a 58 gradi Celsius, consentendo al forward primer di associarsi alla parte complementare del suo stampo di DNA a singolo filamento.La temperatura di ricottura dipende direttamente dalla lunghezza e dalla composizione del primer.

Nella fase di estensione, la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA che è complementare al filamento del modello di DNA.Aggiungendo nuclei liberi complementari allo stampo nella direzione da 5′ a 3′ dalla miscela di reazione.La temperatura di questo passaggio dipende dalla DNA polimerasi utilizzata.

Dopo il primo ciclo, si ottiene un bersaglio di DNA a doppio filamento.

Quindi, entra nel secondo ciclo.Il DNA a doppio filamento viene denaturato per produrre due molecole di DNA a singolo filamento.

Nella fase successiva, la temperatura di reazione viene abbassata, i primer vengono ricotti su ciascun modello di DNA a filamento singolo e la sonda Taq-man viene ricotta sulla parte complementare del DNA target.

La sonda TaqMan è costituita da un fluoroforo legato in modo covalente all'estremità 5′ della sonda oligonucleotidica.Quando eccitato dalla sorgente luminosa del cycler, il fluoroforo emette fluorescenza.Inoltre, la sonda è composta da un quencher all'estremità 3′.La vicinanza del gene reporter al quencher impedisce il rilevamento della fluorescenza.

Nella fase di estensione, la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento.Quando la polimerasi raggiunge la sonda TaqMan, la sua attività 5'nucleasica endogena scinde la sonda, separando il colorante dal quencher.

Ad ogni ciclo di PCR, vengono rilasciate più molecole di colorante, determinando un aumento dell'intensità della fluorescenza proporzionale al numero di ampliconi sintetizzati.

Questo metodo permette di stimare il numero di una data sequenza presente nel campione.Il numero di frammenti di DNA a doppio filamento raddoppia in ogni ciclo.Pertanto, la PCR può essere utilizzata per analizzare campioni molto piccoli.

Per misurare il segnale fluorescente, la lampada alogena al tungsteno, il filtro di eccitazione, il riflettore, l'obiettivo, il filtro di emissione e la fotocamera CCD con dispositivo ad accoppiamento di carica.

PASSAGGIO 4 Rileva

Per misurare il segnale fluorescente, la lampada alogena al tungsteno, il filtro di eccitazione, il riflettore, l'obiettivo, il filtro di emissione e la fotocamera CCD con dispositivo ad accoppiamento di carica.

La luce filtrata dalla lampada viene riflessa dal riflettore, passa attraverso la lente del condensatore e viene focalizzata al centro di ciascun foro.Quindi la fluorescenza emessa dal foro viene riflessa dallo specchio, passa attraverso il filtro di emissione e viene rilevata dalla camera CCD.In ogni ciclo di PCR, la luce del fluoroforo autoeccitata può essere rilevata dal CCD.

Converte la luce catturata in dati digitali.Questo metodo è chiamato PCR in tempo reale e consente il monitoraggio in tempo reale dell'andamento della reazione PCR.