La colonna tappata

Dopo che la colonna è stata tappata, la resa di RNA è ridotta o addirittura impossibile da purificare l'RNA e la massa di RNA ottenuta è bassa.

Analisi delle cause comuni:

1. Le interruzioni del campione non sono complete.

La rottura del campione non causa il blocco completo della COLONNA DI PULIZIA DEL DNA, ma influisce sulla resa e sulla qualità dell'RNA.Si consiglia un'operazione di macinazione rapida in azoto liquido sufficiente quando si rompono i campioni, provare a frantumare la parete cellulare del campione, la membrana cellulare e altri tessuti.Per campioni vegetali di polioli polisaccaridi, si consiglia di utilizzare Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Durante l'aspirazione del supernatante del campione separato con la colonna di pulizia del DNA, l'eventuale precipitato frammentato cellulare può essere inalato.

I sedimenti frammentati cellulari prelevati causeranno il blocco della colonna SOLO RNA quando viene eseguita l'operazione di adsorbimento dell'RNA (vedere il passaggio 6).Si consiglia di fare attenzione durante l'aspirazione di questo supernatante per evitare che i detriti cellulari vengano aspirati.

3. La quantità iniziale del campione è eccessiva.

Un utilizzo eccessivo del campione provocherà una frammentazione incompleta del campione o una lisi cellulare incompleta da parte del tampone PSL1, con conseguente blocco della colonna di purificazione durante la purificazione.Kit di isolamento dell'RNA totale delle piante Ogni singolo campione operativo purificato è di 50 mg.Per i campioni vegetali di polioli polisaccaridi, ti consigliamo di provare Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. La temperatura della centrifuga è troppo bassa.

L'intero processo di isolamento e purificazione dell'RNA viene effettuato a temperatura ambiente (20-25°C), tranne per il fatto che il tessuto del campione viene rotto dall'azoto liquido. La temperatura di alcune centrifughe criogeniche è inferiore a 20℃, che può causare il blocco della colonna di pulizia del DNA e/o della colonna solo RNA.Se ciò accade, impostare la temperatura della centrifuga su 20-25℃, Eassicurarsi che la miscela di lisi e/o il supernatante aggiunto di etanolo sia stato preriscaldato a 37°C.

Nessun RNA estratto o la resa di RNA è bassa

Di solito ci sono molti fattori che influenzano l'efficienza del recupero, come: contenuto di RNA del campione, metodo operativo, volume di eluizione, ecc.

Analisi delle cause comuni come di seguito:

1.Durante l'operazione è stato eseguito un bagno di ghiaccio o una centrifugazione a bassa temperatura (4°C).

Suggerimento: operare a temperatura ambiente (15-25°C) durante l'intero processo, non fare il bagno di ghiaccio e la centrifugazione a bassa temperatura.

2. L'RNA è stato degradato a causa di un'errata conservazione del campione o di una conservazione a lungo termine del campione.

Raccomandazione: i campioni appena raccolti devono essere rapidamente congelati in azoto liquido e quindi conservati a -80 ° C per lungo tempo, evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti dei campioni;o immergere immediatamente i campioni nella soluzione di stabilizzatore di RNA RNAlater (campioni animali).

3. La frammentazione e la lisi insufficienti del campione portano al blocco della colonna di purificazione.

Suggerimento: durante la macinazione del tessuto, assicurarsi che sia sufficientemente macinato e trasferirlo rapidamente nel tampone PSL1 pre-preparato (confermare che sia stata aggiunta la proporzione corretta di β-ME, vedere il passaggio 1 della procedura).

4.L'eluente è stato aggiunto in modo errato.

Suggerimento: accertarsi che ddH2O privo di RNasi sia gocciolato al centro della membrana della colonna di purificazione.

5.Non è stato aggiunto il volume corretto di etanolo assoluto al tampone PSL2 o al tampone PRW2.

Suggerimento: seguire le istruzioni, aggiungere il volume corretto di etanolo assoluto al tampone PSL2 e al tampone PRW2 e miscelare bene prima di utilizzare il kit.

6.La quantità di campione di tessuto non è appropriata.

Suggerimento: utilizzare 50 mg di tessuto per 500 ml di tampone PSL1.L'uso di troppo tessuto ridurrà la quantità di RNA estratto e anche la purezza dell'RNA risultante sarà ridotta.Si consiglia vivamente che il dosaggio iniziale del campione non superi i 50 mg per operazione di estrazione dell'RNA.

7.Volume di eluizione inappropriato o eluizione incompleta.

Suggerimento: il volume dell'eluente della colonna di purificazione è di 50-200 μl;se l'effetto di eluizione non è soddisfacente, si consiglia di prolungare il tempo a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di ddH2O privo di RNasi preriscaldato, ad esempio 5-10 minuti.

8.La colonna di purificazione presenta residui di etanolo dopo il lavaggio con BufferPRW2.

Suggerimento: se la provetta vuota viene centrifugata per 1 minuto e rimane ancora etanolo dopo il lavaggio nel tampone PRW2, è possibile aumentare il tempo di centrifugazione della provetta vuota a 2 minuti oppure posizionare la colonna di purificazione a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere completamente l'etanolo residuo.

9.Il kit è stato utilizzato in modo errato.

Suggerimento: per i campioni vegetali di polisaccaridi polifenolici, l'utilizzo di kit comuni come il kit di isolamento dell'RNA totale delle piante potrebbe non essere in grado di ottenere campioni di RNA ideali.Si consiglia di utilizzare Plant Total RNA IsolationKit Plus, appositamente progettato per campioni di piante di polisaccaridi polifenolici.Un kit appositamente sviluppato per l'estrazione di RNA da campioni vegetali di polifenoli e polisaccaridi.

Il valore OD260/OD280 è basso

L'eluizione dell'RNA con ddH2O e utilizzata per le letture dello spettrofotometro produce bassi valori OD260/OD280.Si consiglia di utilizzare Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 (anziché ddH2O privo di RNasi per eluire l'RNA) per ottenere valori OD260/OD280 relativamente corretti, vedere "Saggi di concentrazione e purificazione dell'RNA" a pagina 19.

L'RNA purificato viene degradato

La qualità dell'RNA purificato è correlata a fattori quali la conservazione del campione, la contaminazione da RNasi e la manipolazione.

Analisi delle cause comuni:

1. I campioni di tessuto non sono stati conservati in tempo dopo la raccolta.

Raccomandazione: se i campioni di tessuto non vengono utilizzati in tempo dopo la raccolta, conservarli immediatamente in azoto liquido a bassa temperatura o trasferirli a -80°C per una conservazione a lungo termine dopo il congelamento rapido in azoto liquido, oppure immergere immediatamente i campioni nella soluzione di stabilizzatore di RNA RNAlater (campioni animali).Per l'estrazione dell'RNA, provare a utilizzare campioni di tessuto appena raccolti.

2. Congelamento e scongelamento ripetuti di campioni di tessuto.

Suggerimento: quando si conservano i campioni di tessuto, è meglio tagliarli in piccoli pezzi per la conservazione ed estrarne una parte quando li si utilizza per evitare la degradazione dell'RNA causata dal ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni.

3. L'RNasi viene introdotta nella sala operatoria o non indossa guanti monouso, maschere, ecc.

Suggerimento: gli esperimenti di estrazione dell'RNA vengono eseguiti al meglio in operazioni separate sull'RNA e il tavolo di laboratorio deve essere pulito prima dell'esperimento e durante l'esperimento devono essere indossati guanti e maschere usa e getta per evitare la degradazione dell'RNA causata dall'introduzione di RNase nella massima misura.

4.Il reagente è contaminato da RNasi durante l'uso.

Suggerimento: sostituire con una nuova serie di kit di estrazione dell'RNA totale delle piante per esperimenti correlati.

5. Le provette per centrifuga ei puntali delle pipette utilizzati per la manipolazione dell'RNA sono contaminati da RNasi.

Suggerimento: assicurarsi che le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, le pipette, ecc. utilizzati nell'estrazione dell'RNA siano tutti privi di RNasi.

Manuali di istruzioni:

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Manuale di istruzioni