Diverse invenzioni rivoluzionarie nella storia della tecnologia di rilevamento nella mia mente sono la tecnologia di immunoetichettatura basata sul principio del legame specifico antigene-anticorpo, la tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento.Oggi parleremo della tecnologia PCR.Secondo l'evoluzione della tecnologia PCR, le persone dividono abitualmente la tecnologia PCR in tre generazioni: tecnologia PCR ordinaria, tecnologia PCR quantitativa fluorescente in tempo reale e tecnologia PCR digitale.
Ctecnica PCR comune
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis ha inventato la reazione a catena della polimerasi (reazione a catena della polimerasi, PCR) nel 1983. Si dice che mentre guidava la sua ragazza, improvvisamente ebbe un lampo di ispirazione e pensò al principio della PCR (sui benefici della guida).Kary Mullis è stato insignito del Premio Nobel per la Chimica nel 1993. Il New York Times ha commentato: "Molto originale e significativo, quasi a dividere la biologia in ere pre-PCR e post-PCR.
Il principio della PCR: sotto la catalisi della DNA polimerasi, il DNA del filamento madre viene utilizzato come modello e il primer specifico viene utilizzato come punto di partenza dell'estensione e il DNA del filamento figlia complementare al DNA modello del filamento madre viene copiato in vitro attraverso denaturazione, ricottura, estensione e altri passaggi.È una tecnologia di amplificazione della sintesi del DNA in vitro, che può amplificare rapidamente e in modo specifico qualsiasi DNA target in vitro.
Vantaggi della PCR ordinaria
1.Metodo classico, standard internazionali e nazionali completi
2.Costo inferiore dei reagenti dello strumento
3.I prodotti di PCR possono essere recuperati per altri esperimenti di biologia molecolare
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Svantaggi della PCR ordinaria
1.facile da inquinare
2.operazione ingombrante
3.solo analisi qualitativa
4.Sensibilità moderata
5.C'è un'amplificazione non specifica e quando la banda non specifica ha le stesse dimensioni della banda target, non può essere distinta
CPCR basata sull'elettroforesi apillare
In risposta alle carenze della normale PCR, alcuni produttori hanno introdotto strumenti basati sul principio dell'elettroforesi capillare.La fase di elettroforesi dopo l'amplificazione PCR è completata nel capillare.La sensibilità è maggiore e la differenza di diverse basi può essere distinta e l'amplificazione può essere calcolata da MAERKER.contenuto del prodotto.Lo svantaggio è che il prodotto PCR deve ancora essere aperto e inserito nello strumento, e c'è ancora un grande rischio di contaminazione.
CapillareEelettroforesi
2. Tecnologia PCR quantitativa fluorescente in tempo reale (Quantitative Real-time PCR, qPCR).La PCR quantitativa fluorescente, chiamata anche PCR in tempo reale, è una nuova tecnologia quantitativa dell'acido nucleico sviluppata da PE (Perkin Elmer) nel 1995. La storia dello sviluppo della PCR quantitativa fluorescente è una storia di lotte emozionanti di giganti come ABI, Roche e Bio-Rad.Se sei interessato, puoi dare un'occhiata.Questa tecnica è attualmente la tecnica di PCR semiquantitativa più matura e ampiamente utilizzata.
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Metodo colorante fluorescente (SYBR Green I):SYBR Green I è il colorante legante il DNA più comunemente usato per la PCR quantitativa, che si lega in modo non specifico al DNA a doppio filamento.Allo stato libero, SYBR Green emette una debole fluorescenza, ma una volta legato al DNA a doppio filamento, la sua fluorescenza aumenta di 1000 volte.Pertanto, il segnale fluorescente totale emesso da una reazione è proporzionale alla quantità di DNA a doppio filamento presente e aumenterà con l'aumento del prodotto amplificato.Poiché il colorante si lega in modo non specifico al DNA a doppio filamento, possono essere generati risultati falsi positivi.
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Metodo con sonda fluorescente (tecnologia Taqman): DuranteAmplificazione PCR, una sonda fluorescente specifica viene aggiunta contemporaneamente a una coppia di primer.La sonda è un oligonucleotide lineare, con un gruppo reporter fluorescente e un gruppo quencher fluorescente marcati rispettivamente su entrambe le estremità.Quando la sonda è intatta, il segnale fluorescente emesso dal gruppo reporter viene assorbito dal gruppo quencher e il rilevamento Non c'è segnale fluorescente;durante l'amplificazione della PCR (nella fase di estensione), l'attività Dicer 5'-3' dell'enzima Taq digerirà e degraderà la sonda, in modo che il gruppo fluorescente del reporter e il gruppo fluorescente del quencher siano separati, in modo che il sistema di monitoraggio della fluorescenza possa ricevere il segnale fluorescente, cioè ogni volta che viene amplificata una catena di DNA, si forma una molecola fluorescente, che realizza la completa sincronizzazione dell'accumulo di segnali fluorescenti e la formazione di prodotti della PCR.Il metodo della sonda Taqman è il metodo di rilevamento più comunemente utilizzato nel rilevamento clinico.
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Vantaggi della qPCR
1.Il metodo è maturo e l'attrezzatura e i reagenti di supporto sono completi
2.Costo medio dei reagenti
3.facile da usare
4.Elevata sensibilità e specificità di rilevamento
Svantaggi di qPCR
La mutazione del gene bersaglio porta al mancato rilevamento.
Non è possibile determinare il risultato del rilevamento del modello a bassa concentrazione.
C'è un grande errore quando si utilizza la curva standard per il rilevamento quantitativo.
3. Tecnologia PCR digitale (PCR digitale, dPCR).
La PCR digitale è una tecnica per la quantificazione assoluta delle molecole di acido nucleico.Rispetto alla qPCR, la PCR digitale può leggere direttamente il numero di molecole di DNA/RNA, che è la quantificazione assoluta delle molecole di acido nucleico nel campione di partenza.Nel 1999 Bert Vogelstein e Kenneth W. Kin-zler proposero formalmente il concetto di dPCR.
Nel 2006, Fluidigm è stata la prima a produrre uno strumento dPCR commerciale basato su chip.Nel 2009, Life Technologies ha lanciato i sistemi OpenArray e QuantStudio 12K Flex dPCR.Nel 2013, Life Technologies ha lanciato il sistema QuantStudio 3DdPCR, che utilizza la tecnologia dei chip microfluidici su nanoscala ad alta densità per distribuire uniformemente i campioni a 20.000 singole cellule.bene nella reazione.
Nel 2011, Bio-Rad ha lanciato lo strumento dPCR QX100 basato su goccioline, che utilizza la tecnologia acqua in olio per distribuire uniformemente il campione a 20.000 goccioline di acqua in olio e utilizza un analizzatore di goccioline per analizzare le goccioline.Nel 2012, RainDance ha lanciato lo strumento RainDrop dPCR, azionato da gas ad alta pressione, per dividere ciascun sistema di reazione standard in un'emulsione di reazione contenente da 1 a 10 milioni di microgoccioline a livello di picolitri.
Finora, la PCR digitale ha formato due fazioni principali, il tipo di chip e il tipo di goccioline.Indipendentemente dal tipo di PCR digitale, i suoi principi fondamentali sono la limitazione della diluizione, l'endpoint PCR e la distribuzione di Poisson.Il sistema di reazione PCR standard contenente modelli di acido nucleico è suddiviso equamente in decine di migliaia di reazioni PCR, che sono distribuite su chip o microgoccioline, in modo che ogni reazione contenga il più possibile una molecola modello e venga eseguita una reazione PCR modello a singola molecola.Leggendo la fluorescenza Viene contata la presenza o l'assenza del segnale e la quantificazione assoluta viene eseguita dopo la calibrazione della distribuzione statistica di Poisson.
Di seguito sono riportate le caratteristiche di diverse piattaforme PCR digitali che ho utilizzato:
1. Bio-Rad PCR digitale droplet Bio-Rad QX200QX200 è una piattaforma PCR digitale molto classica, il processo di rilevamento di base: 20.000 campioni vengono generati dal generatore di goccioline Le micro-goccioline di acqua in olio vengono amplificate su una normale macchina PCR e infine il segnale di fluorescenza di ogni micro-gocciolina viene letto da un lettore di micro-goccioline.L'operazione è più complicata e il rischio di inquinamento è medio.
PCR digitale a microgocce Xinyi TD1Xinyi TD1 è una piattaforma PCR digitale domestica, il processo di rilevamento di base: genera 30.000-50.000 goccioline di acqua in olio attraverso un generatore di goccioline, amplifica su un comune strumento PCR e infine passa Il lettore di goccioline legge il segnale fluorescente di ciascuna gocciolina.Sia la generazione che la lettura delle goccioline in questa piattaforma vengono eseguite in un chip dedicato con basso rischio di contaminazione.
STILLA Naica micro-goccioline PCR digitaleSTILLA Naica è una piattaforma PCR digitale relativamente nuova.Il processo di rilevamento di base è: aggiungere la soluzione di reazione al chip, inserire il chip nel sistema di generazione e amplificazione di microgoccioline e generare 30.000 microgoccioline.Distribuire sul chip e l'amplificazione PCR è completata sul chip.Quindi il chip amplificato viene trasferito al sistema di analisi della lettura di micro-goccioline e il segnale fluorescente viene letto scattando immagini.Poiché l'intero processo avviene in un chip chiuso, il rischio di contaminazione è basso.
4. PCR digitale con chip ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D è un'altra classica piattaforma PCR digitale basata su chip.Il suo processo di rilevamento di base è: aggiungere la soluzione di reazione nello spargitore e distribuire uniformemente la soluzione di reazione sul chip con 20.000 micropozzetti attraverso lo spargitore., metti il chip sulla macchina PCR per amplificare, e infine inserisci il chip nel lettore e scatta una foto per leggere il segnale fluorescente.L'operazione è relativamente complicata e l'intero processo viene eseguito in un chip chiuso e il rischio di contaminazione è basso.
5. PCR digitale con chip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity è una piattaforma PCR digitale di tipo chip relativamente nuova.Il suo processo di rilevamento di base è: aggiungere la soluzione di reazione nell'applicatore e distribuire uniformemente la soluzione di reazione su 10.000 provette PCR fissate nella provetta PCR attraverso l'applicatore.Sul chip microporoso, la soluzione di reazione entra nel chip attraverso l'azione capillare e il tubo PCR con il chip viene posizionato sulla macchina PCR per l'amplificazione, e infine il chip viene inserito nel lettore per leggere il segnale fluorescente scattando una foto.L'operazione è più complicata.Il rischio di contaminazione è basso.
I parametri di ciascuna piattaforma PCR digitale sono riassunti come segue:
Gli indicatori di valutazione della piattaforma PCR digitale sono: il numero di unità split, il numero di canali fluorescenti, la complessità dell'operazione e il rischio di contaminazione.Ma la cosa più importante è l'accuratezza del rilevamento.Un modo per valutare le piattaforme PCR digitali è utilizzare più piattaforme PCR digitali per verificarsi a vicenda e un altro modo è utilizzare sostanze standard con valori accurati.
Vantaggi della dPCR
1.Raggiungere una quantificazione assoluta
2.Maggiore sensibilità e specificità
3.Può rilevare campioni a basso numero di copie
Svantaggi della dPCR1. Attrezzature e reagenti costosi 2. Operazioni complicate e lunghi tempi di rilevamento 3. Raggio di rilevamento ristretto
Allo stato attuale, le tre generazioni della tecnologia PCR presentano i propri vantaggi e svantaggi e ciascuna ha i propri campi di applicazione e non è una relazione che una generazione sostituisca l'altra.Il continuo progresso della tecnologia ha iniettato nuova vitalità nella tecnologia PCR, consentendole di sbloccare una direzione di applicazione dopo l'altra, rendendo il rilevamento dell'acido nucleico più conveniente e preciso.
Fonte: il dottor Yuan ti porta per i test
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Tempo di pubblicazione: 18-nov-2022
