Macchina PCR|Capisci davvero?

Tecnologia PCR vincitrice del Premio Nobel

Nel 1993, lo scienziato americano Mulis ricevette il premio Nobel per la chimica e il suo successo fu l'invenzione della tecnologia PCR.La magia della tecnologia PCR sta nelle seguenti caratteristiche: in primo luogo, la quantità di DNA da amplificare è estremamente ridotta e teoricamente una molecola può essere utilizzata per l'amplificazione;in secondo luogo, l'efficienza di amplificazione è elevata e la quantità del gene bersaglio è esponenziale.Amplificazione, più di 10 milioni di volte in poche ore.Ora lo strumento PCR è stato ampiamente utilizzato nella ricerca sulle scienze della vita e in molti altri aspetti.

Diversi modelli e produttori di termociclatori possono presentare prestazioni e ripetibilità diverse.Queste differenze influenzano non solo l'efficienza della PCR, ma anche l'accuratezza e la coerenza dei dati ottenuti.Comprendere le caratteristiche della macchina PCR può aiutarci a massimizzare il successo dei nostri esperimenti.

Modulo di riscaldamento

L'accuratezza della temperatura del termociclatore può essere decisiva per il successo o il fallimento della PCR.Anche la costanza della temperatura da pozzo a pozzo sul blocco riscaldante è fondamentale per ottenere risultati PCR affidabili e riproducibili.

Un modo per garantire l'accuratezza termica è testare frequentemente utilizzando i kit di verifica della temperatura e ricalibrare secondo necessità da un professionista qualificato.I test di verifica della temperatura sono generalmente utilizzati per:

Precisione da pozzo a pozzo relativa alla temperatura impostata in modalità isotermica

Precisione da pozzo a pozzo relativa alla temperatura impostata dopo la conversione della temperatura

Precisione della temperatura del coperchio termico

Controllo della temperatura di ricottura del primer

Il controllo della temperatura del gradiente è una funzione dello strumento PCR che facilita l'ottimizzazione della ricottura dei primer nella PCR.Lo scopo dell'impostazione del gradiente è quello di ottenere temperature variabili tra i moduli e, con un aumento e una diminuzione della temperatura di ≥2°C tra ciascuna colonna, è possibile testare simultaneamente temperature diverse per ottenere la temperatura ottimale di ricottura del primer.Teoricamente, un vero gradiente raggiunge la temperatura lineare tra i moduli.

Tuttavia, i tradizionali termociclatori a gradiente impiegano in genere un singolo blocco termico e controllano la temperatura attraverso due elementi di riscaldamento e raffreddamento situati a entrambe le estremità, spesso determinando le seguenti limitazioni:

È possibile impostare solo due temperature: le temperature alta e bassa per la ricottura del primer sono impostate su entrambe le estremità del modulo termico e non è possibile ottenere un'impostazione precisa di altre temperature tra il modulo

A causa dello scambio termico tra le diverse colonne, è più probabile che la temperatura tra le diverse regioni del modulo segua una curva sigmoidale piuttosto che un vero gradiente lineare.

Temperatura del campione

La capacità del termociclatore di controllare la temperatura del campione è molto importante per l'accuratezza dei risultati della PCR.Parametri specifici dello strumento come velocità di rampa, tempi di attesa e algoritmi sono fondamentali per prevedere la temperatura del campione.

La velocità di riscaldamento e raffreddamento della macchina per PCR indica che la temperatura cambia tra le fasi della PCR che si verificano in un certo periodo di tempo.Poiché il trasferimento del calore dal modulo al campione richiede un certo tempo, la velocità effettiva di riscaldamento e raffreddamento del campione sarà più lenta.Pertanto, la definizione di velocità di variazione della temperatura deve essere distinta e compresa.

La velocità di rampa massima o di picco del modulo rappresenta la variazione di temperatura più rapida che il modulo può raggiungere in un periodo di tempo molto breve durante la rampa.

La velocità media della rampa del blocco rappresenta la velocità di variazione della temperatura in un periodo di tempo più lungo e fornirà una misura più rappresentativa della velocità della macchina PCR.

La velocità massima di riscaldamento e raffreddamento del campione e la velocità media di riscaldamento e raffreddamento del campione riflettono la temperatura effettiva ottenuta dal campione.La velocità di riscaldamento e raffreddamento del campione fornirà un confronto più accurato delle prestazioni della macchina per PCR e del suo potenziale impatto sui risultati della PCR.

Quando si esegue la sostituzione del termociclatore, si consiglia di utilizzare uno strumento con un programma di ramp rate che simuli la modalità precedente per una sostituzione più semplice e un impatto minimo sulla ripetibilità della PCR.

Il termociclatore deve essere progettato per intervalli di tempo solo dopo che il campione ha raggiunto la temperatura impostata.In questo modo, il tempo in cui il campione viene mantenuto alla temperatura impostata sarà mantenuto più accuratamente con le corrispondenti condizioni di ciclo richieste nella procedura operativa.

I termociclatori utilizzano spesso algoritmi matematici complessi per garantire che i campioni possano raggiungere rapidamente una temperatura impostata in base a un programma preimpostato.In base al volume del sistema di reazione e allo spessore della plastica PCR utilizzata, l'algoritmo può prevedere la temperatura del campione e il tempo necessario per raggiungere la temperatura impostata.Facendo affidamento su questi algoritmi, durante il processo di riscaldamento o raffreddamento del termociclatore, la temperatura del blocco solitamente supera il valore impostato attraverso un processo chiamato overshoot o undershoot del blocco termico.Tale configurazione garantisce che il campione raggiunga la temperatura impostata il più rapidamente possibile senza superare o sottoelevare se stesso.

Produttività sperimentale

I fattori che possono aumentare la produttività di un termociclatore includono velocità di rampa, configurazioni di blocchi termici e integrazione di piattaforme di automazione.

La velocità di riscaldamento e raffreddamento del termociclatore rappresenta la velocità alla quale raggiunge la temperatura impostata.Più velocemente la temperatura sale e scende, più veloce sarà la PCR, il che significa che più esperimenti possono essere completati in un dato periodo di tempo.Inoltre, gli esperimenti possono essere accelerati utilizzando DNA polimerasi più veloci.

Anche la progettazione del modulo termociclatore è fondamentale per gli esperimenti di PCR.Ad esempio, i moduli sostituibili consentono flessibilità nel numero di campioni per corsa.Inoltre, i moduli di riscaldamento con moduli controllabili individualmente sono ideali per l'esecuzione simultanea di diversi programmi PCR su un termociclatore.

Per la PCR automatizzata ad alto rendimento, il software che controlla il sistema di gestione del pipettaggio deve essere programmabile e compatibile.I sistemi automatizzati sono ideali per l'esecuzione di reazioni PCR ad alto rendimento perché possono essere eseguiti continuamente con un intervento umano minimo, riducendo così al minimo il tempo necessario per l'installazione sperimentale manuale e aumentando il numero di reazioni in un determinato periodo di tempo.

Affidabilità, durata e garanzia di qualità dei termociclatori

Oltre alle prestazioni e alle capacità di produttività, la macchina PCR dovrebbe anche essere in grado di resistere a determinati usi ripetuti, stress ambientali e condizioni di spedizione.Alcuni produttori possono riferire su come lo strumento esegue i test di affidabilità e durata.Il rilevamento dello strumento PCR corrispondente include:

Affidabilità: gli impianti meccanici vengono utilizzati per eseguire test ripetuti su componenti di strumenti utilizzati di frequente come coperchi termici, pannelli di controllo/touchscreen e moduli di cicli di temperatura.

Pressione ambiente: le camere ambientali possono essere utilizzate per simulare diverse condizioni di esperimenti di routine, come temperatura, umidità.

Test di spedizione: è possibile eseguire test intensivi di urti e vibrazioni secondo gli standard dell'International Safety Shipping Association per garantire che lo strumento possa arrivare in condizioni operative integre.

Garanzia e assistenza per la manutenzione della macchina PCR

Nonostante i rigorosi test di affidabilità e durata, i termociclatori hanno inevitabilmente problemi tecnici durante la vita dello strumento.Per la massima tranquillità, al momento dell'acquisto di uno strumento è necessario prendere in considerazione la garanzia, l'assistenza e la manutenzione del produttore.

La flessibilità di servizi come la manutenzione in loco/restituzione in fabbrica, i servizi di monitoraggio remoto e gli strumenti sostitutivi nel processo di manutenzione, ecc., per ridurre l'impatto sull'efficienza del lavoro.

La durata del periodo di garanzia, i tempi di consegna del servizio, l'accessibilità del supporto tecnico e le competenze del personale di supporto professionale.

Fattibilità dell'installazione, del funzionamento, della cooperazione e della verifica dello strumento per soddisfare i requisiti normativi di laboratorio e correlati.Sono disponibili servizi di manutenzione come verifica della temperatura, test e calibrazione per garantire che lo strumento funzioni correttamente con i parametri corrispondenti.

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