Suggerimenti per migliorare il recupero della colla

1. Aumentare il carico del campione durante l'elettroforesi.

2. Utilizzare un tampone per elettroforesi appena preparato.

3. Quando si taglia la colla, provare a tagliare solo la colla con strisce per ridurre il volume del taglio della colla: non è necessaria la colla con pochi frammenti di scopo, altrimenti influirà sul tasso di recupero.

4. Dopo aver sciolto due o più pezzi di colla, utilizzare un tubo indipendentemente dal volume e trasferirlo nella stessa colonna.

5. La soluzione aggiunta nel sol può essere un po' di più, il che favorisce maggiormente il legame del DNA alla membrana, ma generalmente non supera i 750ul.

6. La chiave per il recupero del gel è legare il DNA alla colonna attraverso la concentrazione salina, l'acidità (carica) e l'idrofobicità della soluzione nella colonna.Pertanto, se il pH del tampone di elettroforesi è troppo alto, è possibile aggiungere al sol 10 ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC);per intercettare meglio le molecole di DNA sulla membrana, è possibile aggiungere a caldo nel liquido il 30% di isopropanolo dopo aver sciolto la colla.

7. Prima di aggiungere l'eluente, lasciare la colonna a temperatura ambiente per alcuni minuti (circa 10 minuti) per far evaporare completamente l'etanolo.

8. Infine, aggiungere meno eluente per ridurre al minimo il volume di recupero.Generalmente, per l'eluizione si usa 30-50μl di eluente (non troppo poco, altrimenti non sarà in grado di bagnare la membrana, che non favorisce l'eluizione);le goccioline di eluizione si trovano al centro della membrana, per eluire completamente il DNA legato alla membrana.

9. Dopo aver aggiunto l'eluente, può essere eluito in un bagno d'acqua di 55 gradi per 5 minuti o posto in un bagno d'acqua di 50 gradi per più di 10 minuti, o sigillato con un parafilm a 4 gradi durante la notte, e poi centrifugato per il recupero il giorno successivo, l'effetto è buono.

10.Riaggiungere l'eluato centrifugato alla colonna di adsorbimento e centrifugare nuovamente.

Metodi e procedure dettagliati per il recupero del prodotto PCR

1. Riciclo ordinario della gomma

Se vuoi recuperare la colla, è meglio usare un kit, che è conveniente e ha un tasso di recupero leggermente più alto.Se hai davvero bisogno di recuperarlo manualmente, puoi aggiungere 3 volte il volume di TE dopo aver tagliato la colla.Dopo la fusione a bagnomaria, il fenolo, il fenolo/cloroformio vengono estratti in modo pulito e l'etanolo viene precipitato.Questo è tutto.

2. Recupero del DNA da gel a basso punto di fusione

Purificazione dei frammenti di DNA Aggiungere TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8.0, 0.1 mmol/l EDTA) pari al volume del gel e porre in un bagno d'acqua a 65°C per 5 minuti per dissolvere completamente il gel.

Dopo che è stato portato a temperatura ambiente, è stata aggiunta una quantità uguale di fenolo (saturato con TE, TE è stato sigillato nello strato superiore e lo strato inferiore di fenolo è stato rimosso) e la miscela è stata delicatamente miscelata (non è richiesta alcuna miscelazione) e centrifugata a 12.000 rpm per 3 minuti.Ripeti 1-2 volte.

Prendere il surnatante, aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3mol/L (pH 5,2) e 2,5 volte il volume di etanolo assoluto per eseguire la precipitazione dell'etanolo.Sciogliere il DNA purificato con una quantità appropriata di TE, misurare il contenuto e preparare per l'uso (può essere utilizzato per l'analisi della struttura del gene bersaglio, la preparazione della sonda, ecc.).

3. Recupero PCR con buona specificità di amplificazione

Se la specificità dell'amplificazione PCR è buona, è solo una semplice purificazione e recupero del prodotto PCR.È possibile aggiungere 50 ug/ml di proteinasi K al prodotto PCR, 37 gradi per 1 ora, estrarre una volta con fenolo/cloroformio, estrarre una volta con cloroformio e aggiungere 0,1 volumi del supernatante.L'acetato di sodio è stato recuperato per precipitazione con 2,5 volumi di etanolo assoluto.

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