Nella fase iniziale dell'epidemia, a causa del rapido sviluppo, la diagnosi rapida dei pazienti sospetti è la chiave per prevenire il COVID-19.Alcuni reagenti approvati per il rilevamento dell'acido nucleico hanno un breve tempo di sviluppo e ci sono problemi come conferma frettolosa delle prestazioni, ottimizzazione insufficiente dei reagenti e grandi differenze tra i lotti;I problemi di vari laboratori clinici in vari aspetti del processo di rilevamento dell'acido nucleico possono anche influenzare l'accuratezza dei risultati del rilevamento dell'acido nucleico.Questo articolo si concentrerà sui collegamenti e sui punti chiave nell'attuale rilevamento dell'acido nucleico SARS-CoV-2 e analizzerà i problemi del riesame falso negativo e positivo del rilevamento dell'acido nucleico di laboratorio e dell'incoerenza clinica.

Principi di rilevazione dell'acido nucleico SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 è un virus a RNA con una sequenza genomica di circa 29 kb, con 10 geni, che possono effettivamente codificare 10 proteine.I virus sono composti da RNA e proteine ​​e lo strato più esterno è un rivestimento esterno composto da lipidi e glicoproteine.All'interno, il capside proteico avvolge l'RNA al suo interno, proteggendo così l'RNA facilmente degradabile (P1).

P1 Struttura di SARS-COV-2

I virus invadono le cellule attraverso specifici recettori della superficie cellulare per causare l'infezione e utilizzano le cellule ospiti per replicarsi.

Il principio del rilevamento dell'acido nucleico virale consiste nell'esporre l'RNA virale attraverso un lisato cellulare e quindi utilizzare la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa fluorescente in tempo reale (RT-PCR) per il rilevamento.

La chiave del principio di rilevamento è utilizzare primer e sonde per ottenere una "corrispondenza mirata" di sequenze di acido nucleico, ovvero trovare la sequenza di acido nucleico di SARS-CoV-2 che è diversa da altri virus in circa 30.000 basi (la somiglianza dell'acido nucleico con altri virus) area "bassa"), progettare primer e sonde.

I primer e le sonde sono altamente abbinati alla regione specifica dell'acido nucleico SARS-CoV-2, ovvero la specificità è molto forte.Una volta che il risultato dell'amplificazione RT-PCR fluorescente in tempo reale del campione da testare è positivo, dimostra che SARS-CoV-2 è presente nel campione.Vedi P2.

P2 Fasi della determinazione dell'acido nucleico SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente in tempo reale)

Condizioni e requisiti di laboratorio per il rilevamento dell'acido nucleico SARS-CoV-2

I laboratori di analisi degli acidi nucleici sono i più ideali per gli ambienti a pressione negativa e dovrebbero prestare attenzione al monitoraggio della pressione, mantenere il flusso d'aria ed eliminare gli aerosol.Il personale addetto ai test sugli acidi nucleici deve possedere le qualifiche corrispondenti, ricevere una formazione pertinente sulla reazione a catena della polimerasi e superare la valutazione.Il laboratorio deve essere rigorosamente gestito, suddiviso in zone e al personale irrilevante è severamente vietato l'ingresso.L'area pulita deve essere ventilata e disinfettata sul posto.Gli articoli pertinenti vengono collocati in zone, puliti e sporchi vengono separati, sostituiti in tempo e decontaminati sul posto.Disinfezione di routine: il disinfettante contenente cloro è la soluzione principale per le aree più grandi e l'alcool al 75% può essere utilizzato per le aree più piccole.Un buon modo per affrontare gli aerosol è aprire le finestre per la ventilazione e la disinfezione dell'aria può essere effettuata anche mediante raggi ultravioletti, filtrazione e disinfezione dell'aria.

Collegamenti e parametri chiave della determinazione dell'acido nucleico SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente in tempo reale)

Sebbene i laboratori prestino generalmente molta attenzione alla "rilevazione" dell'acido nucleico, in realtà, anche l'"estrazione" dell'acido nucleico è uno dei passaggi chiave per il rilevamento di successo, che è strettamente correlato alla raccolta e alla conservazione dei campioni di virus.

Attualmente, i campioni respiratori più utilizzati, come i tamponi nasofaringei, utilizzano il secondo metodo, che è una soluzione di inattivazione (conservazione) preparata sulla base dell'estrazione dell'acido nucleico e della soluzione di lisi.Da un lato, questa soluzione di conservazione del virus può denaturare la proteina del virus, perdere la sua attività e non essere più infettiva e migliorare la sicurezza della fase di trasporto e rilevamento;d'altra parte, può rompere direttamente il virus per rilasciare l'acido nucleico, eliminare l'enzima di decomposizione dell'acido nucleico e prevenire il virus.L'RNA è degradato.

Una soluzione di campionamento del virus preparata sulla base della soluzione di lisi dell'estrazione dell'acido nucleico.I componenti principali sono sali bilanciati, agente chelante dell'acido etilendiamminotetracetico, sale di guanidina (isotiocianato di guanidina, cloridrato di guanidina, ecc.), tensioattivo anionico (dodecano) solfato di sodio), tensioattivo cationico (tetradecil trimetil ammonio ossalato), fenolo, 8-idrossichinolina, ditiotreitolo, proteinasi K e altri numerosi o più componenti.Al momento, esistono molti tipi di kit di estrazione dell'acido nucleico e vengono utilizzati diversi reagenti per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico.Anche se viene utilizzato lo stesso reagente di estrazione e purificazione dell'acido nucleico, le procedure di estrazione di ciascun kit sono diverse.

Attualmente, i prodotti del kit di rilevamento dell'acido nucleico approvati dalla National Medical Products Administration sono selezionati in base ai geni ORF1ab, E e N nel genoma SARS-CoV-2.I principi di rilevamento di diversi prodotti sono fondamentalmente gli stessi, ma i loro primer e il design delle sonde sono diversi.Esistono segmenti a bersaglio singolo (ORF1ab), segmenti a doppio bersaglio (ORF1ab, N o E) e segmenti a tre bersagli (ORF1ab, N ed E).La differenza tra rilevamento e interpretazione, estrazione dell'acido nucleico e sistema di reazione RT-PCR fluorescente in tempo reale deve fare riferimento alle istruzioni del kit pertinenti e si raccomanda agli utenti di seguire rigorosamente il metodo di interpretazione specificato nelle istruzioni del kit per l'interpretazione.Le regioni comuni, i primer e le sequenze di sonde amplificate da RT-PCR fluorescente in tempo reale sono mostrate in P3.

P3 La posizione del bersaglio dell'amplicone SARS-CoV-2 sul genoma e la sequenza di primer e sonde

Interpretazione dei risultati della determinazione dell'acido nucleico SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescente RT-PCR)

"Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Second Edition)" ha chiarito per la prima volta i criteri per giudicare i risultati dell'amplificazione di un singolo gene:

1. Nessun Ct o Ct≥40 è negativo;

2. Ct<37 è positivo;

3. Il valore Ct di 37-40 è l'area della scala di grigi.Si consiglia di ripetere l'esperimento.Se il risultato del rifacimento di Ct<40 e della curva di amplificazione presenta dei picchi evidenti, il campione viene giudicato positivo, altrimenti negativo.”

La terza edizione della guida e la quarta edizione della guida hanno continuato i criteri di cui sopra.Tuttavia, a causa dei diversi bersagli utilizzati nei kit commerciali, la suddetta 3a edizione della guida non ha fornito i criteri per determinare la combinazione dei bersagli, sottolineando che prevalgono le indicazioni fornite dal produttore.A partire dalla quinta edizione delle linee guida, sono stati chiariti due obiettivi, in particolare i criteri di giudizio per un unico obiettivo difficile da giudicare.Cioè, se il laboratorio vuole confermare che un caso è positivo per il rilevamento dell'acido nucleico SARS-CoV-2, deve essere soddisfatta una delle due condizioni seguenti:

(1) Due bersagli di SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) nello stesso campione sono risultati positivi mediante RT-PCR fluorescente in tempo reale.Se un singolo target è positivo, è necessario ricampionare e ripetere il test.Se i risultati del test sono Se il singolo bersaglio è ancora positivo, viene giudicato positivo.

(2) Due campioni di RT-PCR fluorescente in tempo reale hanno mostrato un singolo bersaglio positivo contemporaneamente o due campioni dello stesso tipo hanno mostrato un singolo risultato del test positivo del bersaglio, che può essere giudicato positivo.Tuttavia, le linee guida sottolineano anche che i risultati negativi del test dell'acido nucleico non possono escludere l'infezione da SARS-CoV-2.Devono essere esclusi i fattori che possono causare falsi negativi, tra cui la scarsa qualità del campione (campioni respiratori dall'orofaringe e da altre parti), la raccolta del campione troppo presto o troppo tardi, i campioni non sono stati conservati, trasportati ed elaborati correttamente e la tecnologia stessa ha avuto problemi (variazione del virus, inibizione della PCR), ecc.

Cause di falsi negativi nella rilevazione di SARS-CoV-2

Il concetto di "falso negativo" nei test dell'acido nucleico che è attualmente interessato, si riferisce spesso a "falsi negativi" in cui i risultati del test dell'acido nucleico sono incoerenti con le manifestazioni cliniche, cioè i sintomi clinici e i risultati delle immagini sono fortemente sospettati di COVID-19, ma i test dell'acido nucleico sono sempre "negativi" molte volte.Il Centro Laboratorio Clinico della Commissione Sanitaria Nazionale ha spiegato il test “falso negativo” SARS-CoV-2.

(1) C'è una certa quantità di virus nelle cellule della persona infetta.I dati esistenti mostrano che dopo che il corpo è stato infettato dal virus, il virus entra nella gola attraverso il naso e la bocca, quindi nella trachea e nei bronchi, quindi raggiunge gli alveoli.La persona infetta sperimenterà il periodo di incubazione, sintomi lievi e quindi il processo di sintomi gravi e diversi stadi della malattia.E la quantità di virus presente in diverse parti del corpo è diversa.

In termini di carica virale dei tipi di cellule, cellule epiteliali alveolari (tratto respiratorio inferiore)> cellule epiteliali delle vie aeree (tratto respiratorio superiore)> fibroblasti, cellule endoteliali e macrofagi, ecc.;dal tipo di campione, liquido di lavaggio alveolare (il più eccellente)>espettorato con tosse profonda>tampone rinofaringeo>tampone orofaringeo>sangue.Inoltre, il virus può essere rilevato anche nelle feci.Tuttavia, considerando la comodità dell'operazione e l'accettazione dei pazienti, l'ordine del campione clinico comunemente usato è tampone orofaringeo> tampone nasofaringeo> liquido di lavaggio bronchiale (operazione complessa) ed espettorato profondo (di solito tosse secca, difficile da ottenere).

Pertanto, la quantità di virus nelle cellule dell'orofaringe o del rinofaringe di alcuni pazienti è piccola o estremamente bassa.Se per il test vengono prelevati solo campioni dell'orofaringe o del rinofaringe, l'acido nucleico virale non verrà rilevato.

(2) Durante la raccolta del campione non sono state raccolte cellule contenenti virus o l'acido nucleico virale non è stato preservato in modo efficace.

[① Sito di raccolta improprio, ad esempio, quando si raccolgono tamponi orofaringei, la profondità di raccolta non è sufficiente, i tamponi rinofaringei raccolti non vengono raccolti in profondità nella cavità nasale, ecc. La maggior parte delle cellule raccolte possono essere cellule prive di virus;

②I tamponi di campionamento vengono utilizzati in modo errato.Ad esempio, per il materiale della testina del tampone sono consigliate fibre sintetiche come la fibra PE, la fibra di poliestere e la fibra di polipropilene.Le fibre naturali come il cotone sono utilizzate nel funzionamento effettivo (forte assorbimento di proteine ​​e non facile da lavare) e fibre di nylon (scarso assorbimento d'acqua, che porta a un volume di campionamento insufficiente);

③Uso scorretto di provette di conservazione del virus, come l'uso improprio di provette di conservazione in plastica di polipropilene o polietilene che assorbono facilmente gli acidi nucleici (DNA/RNA), con conseguente diminuzione della concentrazione di acido nucleico nella soluzione di conservazione.In pratica, si consiglia di utilizzare plastica polimerica di polietilene-propilene e alcuni contenitori di plastica di polipropilene appositamente trattati per conservare gli acidi nucleici virali.]

[① Sito di raccolta improprio, ad esempio, quando si raccolgono tamponi orofaringei, la profondità di raccolta non è sufficiente, i tamponi rinofaringei raccolti non vengono raccolti in profondità nella cavità nasale, ecc. La maggior parte delle cellule raccolte possono essere cellule prive di virus;

②I tamponi di campionamento vengono utilizzati in modo errato.Ad esempio, per il materiale della testina del tampone sono consigliate fibre sintetiche come la fibra PE, la fibra di poliestere e la fibra di polipropilene.Le fibre naturali come il cotone sono utilizzate nel funzionamento effettivo (forte assorbimento di proteine ​​e non facile da lavare) e fibre di nylon (scarso assorbimento d'acqua, che porta a un volume di campionamento insufficiente);

③Uso scorretto di provette di conservazione del virus, come l'uso improprio di provette di conservazione in plastica di polipropilene o polietilene che assorbono facilmente gli acidi nucleici (DNA/RNA), con conseguente diminuzione della concentrazione di acido nucleico nella soluzione di conservazione.In pratica, si consiglia di utilizzare plastica polimerica di polietilene-propilene e alcuni contenitori di plastica di polipropilene appositamente trattati per conservare gli acidi nucleici virali.]

(4) Il funzionamento del laboratorio clinico non è standardizzato.Le condizioni di trasporto e conservazione dei campioni, il funzionamento standardizzato dei laboratori clinici, l'interpretazione dei risultati e il controllo di qualità sono i fattori chiave per garantire l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati dei test.Secondo i risultati della valutazione esterna della qualità condotta dal Centro laboratori clinici della Commissione sanitaria nazionale dal 16 al 24 marzo 2020, degli 844 laboratori che hanno ricevuto risultati validi, 701 (83,1%) erano qualificati e 143 (16,9%) non lo erano.Qualificato, le condizioni generali dei test di laboratorio sono buone, ma diversi laboratori presentano ancora differenze nell'abilità operativa del personale, nella capacità di interpretazione del campione positivo a bersaglio singolo e nel controllo di qualità.

Come ridurre il falso negativo del rilevamento dell'acido nucleico SARS-CoV-2?

La riduzione dei falsi negativi nella rilevazione dell'acido nucleico dovrebbe essere ottimizzata dai quattro aspetti della produzione di falsi negativi.

(1) C'è una certa quantità di virus nelle cellule della persona infetta.La concentrazione del virus in diverse parti del corpo di persone sospette infette sarà diversa in momenti diversi.Se non c'è la faringe, potrebbe essere nel liquido di lavaggio bronchiale o nelle feci.Se è possibile raccogliere più tipi di campioni contemporaneamente o in diversi stadi della progressione della malattia per il test, contribuirà a evitare falsi negativi.

(2) Le cellule contenenti virus devono essere raccolte durante la raccolta dei campioni.Questo problema può essere risolto in larga misura rafforzando la formazione dei raccoglitori di campioni.

(3) Reagenti IVD affidabili.Effettuando ricerche sulla valutazione delle prestazioni di rilevamento dei reagenti a livello nazionale e discutendo i problemi esistenti, l'efficienza di rilevamento dei reagenti può essere ulteriormente migliorata e la sensibilità dell'analisi può essere migliorata.

(4) Funzionamento standardizzato dei laboratori clinici.Rafforzando la formazione del personale di laboratorio, migliorando continuamente il sistema di gestione della qualità del laboratorio, garantendo divisioni ragionevoli e migliorando la capacità di rilevamento del personale, è possibile ridurre i falsi negativi dovuti a operazioni di laboratorio improprie.

Motivi del nuovo test positivo al test dell'acido nucleico SARS-CoV-2 nei pazienti guariti e dimessi

Il "Piano di diagnosi e trattamento COVID-19 (Trial Seventh Edition)" stabilisce chiaramente che uno dei criteri per la cura e la dimissione dall'ospedale dei pazienti COVID-19 è che due campioni consecutivi del tratto respiratorio abbiano un test dell'acido nucleico negativo (a distanza di almeno 24 ore), ma ce ne sono pochissimi Il test dell'acido nucleico SARS-CoV-2 è risultato nuovamente positivo nei pazienti dimessi per vari motivi.

(1)SARS-CoV-2 è un nuovo virus.È necessario comprendere ulteriormente il suo meccanismo patogenetico, il quadro completo della malattia causata e le caratteristiche del decorso della malattia.Pertanto, da un lato, è necessario rafforzare la gestione dei pazienti dimessi e condurre un'osservazione medica di 14 giorni.Effettuare il follow-up, il monitoraggio della salute e l'orientamento sanitario per approfondire la comprensione dell'intero processo di insorgenza, sviluppo ed esito della malattia.

(2) Il paziente può essere nuovamente infettato dal virus.L'accademico Zhong Nanshan ha dichiarato: Poiché i pazienti guariti hanno anticorpi, SARS-CoV-2 può essere eliminato dagli anticorpi quando invadono di nuovo.Ci sono molte ragioni, che possono essere la causa del paziente guarito, oppure può essere correlata alla mutazione del virus, o anche la causa dei test di laboratorio.Se è il virus stesso, la mutazione SARS-CoV-2 può rendere inefficace l'anticorpo prodotto dal paziente guarito contro il virus mutato.Se il paziente viene nuovamente infettato dal virus mutato, il test dell'acido nucleico può essere nuovamente positivo.

(3) Per quanto riguarda i metodi di prova di laboratorio, ogni metodo di prova ha i suoi limiti.Il rilevamento dell'acido nucleico SARS-CoV-2 è dovuto alla scelta della sequenza genica, alla composizione dei reagenti, alla sensibilità del metodo e ad altri motivi, che portano i kit esistenti ad avere i propri limiti di rilevamento inferiori.Dopo che il paziente è stato trattato, il virus nel corpo diminuisce.Quando la carica virale nel campione da testare è al di sotto del limite inferiore di rilevamento, apparirà un risultato "negativo".Tuttavia, questo risultato non significa che il virus nel corpo sia completamente scomparso.Il virus potrebbe essere presente dopo che il trattamento è stato interrotto.Resurgence”, continua a copiare.Pertanto, si raccomanda di rivedere una volta alla settimana entro 2-4 settimane dopo la dimissione.

(4) L'acido nucleico è il materiale genetico del virus.Il virus viene ucciso dopo che il paziente è stato sottoposto a trattamento antivirale, ma i restanti frammenti di RNA virale sono ancora trattenuti nel corpo umano e non vengono completamente scaricati dal corpo.A volte, in determinate circostanze, può essere più conservato.Molto tempo, e in questo momento il test dell'acido nucleico sarà positivo "transitorio".Con l'estensione del tempo di recupero del paziente, dopo che i frammenti di RNA residui nel corpo si sono gradualmente esauriti, il risultato del test dell'acido nucleico può diventare negativo.

(5) Il risultato del test dell'acido nucleico di SARS-CoV-2 dimostra solo la presenza o l'assenza di RNA virale e non può provare l'attività del virus e se il virus è trasmissibile.È necessario dimostrare se un paziente che ha nuovamente un test dell'acido nucleico positivo diventerà nuovamente una fonte di infezione.È necessario eseguire la coltura del virus su campioni clinici e coltivare un virus "vivo" per dimostrare che è infettivo.

Riepilogo

In sintesi, non è possibile evitare completamente i falsi negativi del test dell'acido nucleico SARS-CoV-2, i nuovi test positivi e altre condizioni incoerenti con le manifestazioni cliniche.Nello screening e nei test effettivi, si raccomanda di combinare sintomi clinici, esami di imaging (TC) ed esperimenti Risultati del test di laboratorio (test dell'acido nucleico + test degli anticorpi specifici del virus) per una diagnosi completa per prevenire diagnosi mancate e diagnosi errate.Se i risultati del test risultano chiaramente incoerenti con le manifestazioni cliniche, si raccomanda di condurre un'analisi completa dell'intero collegamento del test (raccolta del campione, circolazione e collegamenti di elaborazione) per escludere l'infezione precoce del virus SARS-CoV-2, l'infezione ricorrente o combinata con altre infezioni da virus respiratorio, ecc. possibile.Se le condizioni lo consentono, si raccomanda di raccogliere campioni più sensibili come espettorato o fluido di lavaggio alveolare per il riesame.

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