Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unità: ospedale di Jiaozhou, ospedale di Dongfang affiliato all'università di Tongji

Al momento, il tipo di campione principale per il rilevamento dell'acido nucleico del patogeno respiratorio è il tampone faringeo.Esistono molti tipi di soluzioni di conservazione dei campioni comunemente utilizzate, che devono essere tutte refrigerate o congelate per il trasporto e lo stoccaggio;È difficile controllare l'intero processo di bassa temperatura durante il processo di raccolta e trasporto ed è difficile garantire il controllo di qualità prima del test del campione^[1-2].

RNase (RNase) è un'endonucleasi che idrolizza l'RNA, principalmente recidendo i legami fosfodiestere tra i nucleotidi.La molecola RNasi è molto stabile, nella struttura sono presenti legami disolfuro e la sua attività non richiede la presenza di cationi bivalenti, quindi l'RNasi non è facilmente denaturabile ed è facile da rinaturare anche dopo alte temperature o l'uso di denaturanti.Le RNasi sono divise in endogene ed esogene.Le RNasi endogene possono essere rilasciate contemporaneamente alla rottura delle cellule.Pertanto, l'eliminazione del ruolo delle RNasi endogene è un passaggio molto critico nel processo di estrazione dell'RNA.Le RNasi esogene sono ampiamente distribuite.Le RNasi esistono nell'aria, nella pelle umana, nei capelli e nella saliva, che sono ragioni importanti per la facile degradazione dell'RNA^[3].

Interrogazione dati

CANS-CL02-A009 "Applicazione delle linee guida per l'accreditamento della qualità e delle competenze dei laboratori medici nel campo della diagnosi molecolare" nei requisiti tecnici propone che vengano formulati standard di qualità dell'acqua appropriati in base all'applicazione;Contenitori ermetici usa e getta:

RNasi/Classificazione

(1) RNasi A

La ribonucleasi A (RNasi A), derivata dal pancreas bovino, è un'endoribonucleasi che può attaccare specificamente l'estremità 3' dei residui di pirimidina sull'RNA, tagliando la citosina o l'uracile formato da nucleotidi adiacenti.Legame fosfodiestere, il prodotto finale della reazione è un nucleotide pirimidinico 3' e un oligonucleotide con un nucleotide pirimidinico 3' all'estremità.

(2) RNasi T1

La ribonucleasi T1 (RNase T1) è derivata da Aspergillus orjzae, agisce specificamente sul fosfato 3′-terminale della guanina e il sito di scissione è tra il 3′ fosfato della guanina e il 5′ ossidrile dei nucleotidi adiacenti.Il prodotto finale della reazione è acido 3′guanilico e frammenti oligonucleotidici con acido 3′guanilico all'estremità.

(3) RNasi H

La ribonucleasi H (RNase H) è stata scoperta per la prima volta dal tessuto del timo di vitello e il suo gene codificante è stato clonato in Escherichia coli.Può degradare in modo specifico il DNA: filamenti di RNA in duplex ibridi di RNA, risultando in oligonucleotidi e mononucleotidi con estremità 3′-OH e 5′-monofosfato, non può degradare DNA o RNA a singolo o doppio filamento.

RNasi

Funzione e utilizzo

La ribonucleasi può catalizzare la degradazione dell'acido ribonucleico (RNA) e può essere sintetizzata artificialmente.L'unguento medicinale è usato localmente per trattare traumi e dolori articolari.Secondo i rapporti, la ribonucleasi può modificare il metabolismo della cellula ospite, inibire la sintesi del virus, inibire la proliferazione del virus dell'influenza in vitro e inibire la formazione di vaccinia e virus dell'herpes negli embrioni di pollo.Uso clinico dell'iniezione intramuscolare giornaliera di ribonucleasi di 180 mg, utile per il trattamento dell'encefalite epidemica, la ribonucleasi può catalizzare la degradazione dell'acido ribonucleico (RNA) e ora può essere sintetizzata artificialmente.L'unguento medicinale è usato localmente per trattare traumi e dolori articolari.Secondo i rapporti, la ribonucleasi può modificare il metabolismo della cellula ospite, inibire la sintesi del virus, inibire la proliferazione del virus dell'influenza in vitro e inibire la formazione di vaccinia e virus dell'herpes negli embrioni di pollo.L'uso clinico dell'iniezione intramuscolare giornaliera di ribonucleasi di 180 mg è utile per il trattamento dell'encefalite epidemica.

RNasi

Definizione di inibitore

Definizione di unità dell'inibitore dell'RNasi: la quantità di enzima richiesta per inibire il 50% dell'attività dell'RNasi A da 5 ng è un'unità.

Come funzionano gli inibitori della RNasi

Isotiocianato di guanidina:

L'isotiocianato di guanidina è un composto organico con la formula molecolare C2H6N4S.Utilizzato principalmente in medicina biologica, reagenti chimici, ecc. L'isotiocianato di guanidina è un agente di lisi proteica ed è spesso utilizzato come componente principale della soluzione di lisi nei reagenti diagnostici molecolari.Può lisare il tessuto, distruggere la struttura cellulare e dissociare l'acido nucleico dalla nucleoproteina e ha una forte denaturazione a RNasi.Attualmente è l'inibitore della RNasi più efficace.

TRIzol è un nuovo reagente per l'estrazione dell'RNA totale che può estrarre direttamente l'RNA totale da cellule o tessuti.Contiene sostanze come il fenolo e l'isotiocianato di guanidina, che possono distruggere rapidamente le cellule e inibire le nucleasi rilasciate dalle cellule.

(Tuttavia, l'isotiocianato di guanidina è pericoloso per la salute dei ricercatori di laboratorio.)

RNasina:

Glicoproteina acida estratta da fegato di ratto o blastoderma umano.Rnasin è un inibitore non competitivo di RNasi, che può legarsi a vari RNasi per inattivarli.

(Maggiori dettagli: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Halta temperatura:

L'alta temperatura è anche un mezzo comune di denaturazione delle proteine.

Dietilpirocarbonato (DEPC):

DEPC è un inibitore forte ma incompleto della RNasi, che può inibire l'attività della RNasi combinandosi con l'anello imidazolico dell'amminoacido del gruppo attivo della RNasi per denaturare le proteine.

Complesso vanadil ribonucleosidico:

Complesso formato da ioni ossido di vanadio e nucleosidi, che si lega all'RNasi sotto forma di sostanze di transizione, in grado di inibire quasi completamente l'attività dell'RNasi

altro:

Anche SDS, urea, farina fossile, ecc. hanno un certo effetto inibitorio sull'RNasi.

Recensioni di esperti

Tecnico capo di Li Yujie

Direttore del dipartimento di laboratorio, ospedale di Jiaozhou, ospedale di Dongfang affiliato all'università di Tongji

Al fine di prevenire la biodegradazione dell'RNasi esogena, maschere, guanti e cappelli devono essere indossati e sostituiti frequentemente durante il processo di estrazione dell'RNA.Tutta la vetreria deve essere cotta in un forno di essiccazione a 200°C per più di 2 ore.I materiali utilizzati per la cottura al forno, come la plastica, devono essere trattati con acqua DEPC e quindi lavati con acqua distillata.I reagenti oi dispositivi utilizzati per l'estrazione, la conservazione e l'identificazione dell'RNA dovrebbero essere dedicati all'RNA e dovrebbe essere istituita un'area operativa indipendente per l'RNA.

Riferimenti:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Batteri e virus nel rinofaringe immediatamente prima dell'insorgenza di infezioni acute delle vie respiratorie inferiori nei bambini indigeni australiani[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Sezione per il controllo delle infezioni ospedaliere dell'Associazione cinese di medicina preventiva.Linee guida per la raccolta e l'ispezione di campioni microbici clinici [J].Giornale cinese delle infezioni ospedaliere, 2018(20):3192-3200.

[3] "Test clinico diecimila perché volume del test di biologia molecolare"