La verifica delle prestazioni di primer e sonde nella fase iniziale dei reagenti PCR e la determinazione delle condizioni di reazione più adatte sono i prerequisiti per garantire il regolare svolgimento degli esperimenti formali.
Quindi, come dobbiamo confermare la sonda del primer nella fase iniziale?
Gli indicatori principali sono la linea di base, la curva di amplificazione, il valore ct, l'efficienza di amplificazione, il rilevamento di campioni a bassa concentrazione, CV, ecc.
Linea di base
La linea di base è la linea orizzontale nella curva di amplificazione della PCR.Nei primi cicli della reazione di amplificazione PCR, il segnale di fluorescenza non cambia molto e forma una linea retta.Questa linea retta è la linea di base.
Durante lo screening delle sonde primer per PCR, prestare attenzione al fatto che la linea di base sia livellata.La purezza della concentrazione della sonda primer influirà sulla linea di base, ad esempio provocando l'aumento o la diminuzione della linea di base.La linea di base è anche un indicatore molto intuitivo.
Curva di amplificazione
Un altro indicatore intuitivo è la forma della curva di amplificazione.È meglio avere una curva a forma di S per evitare l'amplificazione secondaria o altre curve di amplificazione anomale.
Valore CT
Il numero di cicli corrispondente al punto di flesso dalla linea di base alla crescita esponenziale è il valore Ct.
Per lo stesso campione, diverse sonde di primer determinano curve di amplificazione diverse e il valore Ct corrispondente sarà influenzato dall'efficienza di amplificazione e dal grado di interferenza.In teoria, più piccolo è il valore Ct della sonda primer che scegliamo, meglio è.
Efficienza di amplificazione
Uno dei metodi più affidabili e stabili per valutare l'efficienza dell'amplificazione della PCR è la curva standard, anch'essa ampiamente riconosciuta dai ricercatori.Il metodo prevede la realizzazione di una serie di campioni per controllare il numero relativo di modelli target.Questi campioni sono generalmente realizzati mediante diluizioni seriali di soluzioni stock concentrate, la più comunemente usata è la diluizione 10 volte.Utilizzando una serie di campioni diluiti, utilizzando il programma qPCR standard per amplificare per ottenere il valore Cq e infine tracciare una curva standard in base alla concentrazione di ciascun campione e al valore Cq corrispondente per ottenere l'equazione lineare Cq= -klgX0+b e l'efficienza di amplificazione E=10(-1 /k)-1.Quando si utilizza qPCR per l'analisi quantitativa, l'efficienza di amplificazione deve essere compresa tra 90% e 110% (3,6> k> 3,1).
Rilevamento di campioni a bassa concentrazione
Quando la concentrazione del campione è bassa, i tassi di rilevamento delle diverse sonde di primer sono diversi.Selezioniamo 20 campioni a bassa concentrazione da replicare e il sistema primer-sonda con il più alto tasso di rilevamento è il migliore.
Coefficiente di variazione (CV)
È possibile rilevare 10 campioni duplicati con diverse sonde primer in base allo standard di linea del reagente per il rilevamento dell'amplificazione dell'acido nucleico.
Reagenti quantitativi:
Precisione
L'accuratezza all'interno di un lotto deve soddisfare: il coefficiente di variazione (CV,%) del valore logaritmico della concentrazione di prova è ≤5%.Quando la concentrazione del campione è bassa, il coefficiente di variazione (CV,%) del logaritmo della concentrazione di rilevamento è ≤10%
Reagenti qualitativi:
Precisione
L'accuratezza all'interno di un lotto deve soddisfare:
(1) Coefficiente di variazione del valore Ct (CV,%) ≤5%
Lo stesso campione viene testato in parallelo per 10 volte e i risultati del test dovrebbero essere coerenti
Tempo di pubblicazione: 18 settembre 2021
