Credo che tutti incontreranno sempre questo o quel problema durante le reazioni PCR, ma la maggior parte di essi può essere classificata in due problemi principali:

Amplificazione insufficiente del modello genico (amplificazione);
Troppa amplificazione del gene non bersaglio.
L'uso di additivi è una delle strategie comuni per risolvere questi problemi.Di solito il ruolo degli additivi ha due aspetti:
struttura secondariadei geni (struttura secondaria);
Ridurre l'adescamento non specifico.
Oggi l'editore vi presenterà brevemente gli additivi comuni nelle reazioni PCR e le loro funzioni.
Additivi che riducono la struttura secondaria
solfossido(DMSO)
campioni di geniad alto contenuto di GC.Tuttavia, il DMSO riduce notevolmente anche l'attività della Taq polimerasi.Pertanto, tutti devono bilanciare l'accessibilità del modello e l'attività della polimerasi.L'editor suggerisce di provare diverse concentrazioni di DSMO, ad esempio dal 2% al 10%, per trovare la concentrazione adatta al tuo esperimento.
Detergenti non ionici
I detergenti non ionici, come lo 0,1-1% di Triton X-100, Tween 20 o NP-40, di solito riducono la struttura secondaria del DNA.Sebbene ciò possa aumentare l'amplificazione del gene modello, causerà anche il problema dell'amplificazione non specifica.Quindi, questi additivi funzionano bene per reazioni PCR a basso rendimento senza detriti, ma non così bene per reazioni PRC relativamente impure.Un altro vantaggio dei detergenti non ionici è la riduzione della contaminazione da SDS.Di solito durante il processo di estrazione del DNA, l'SDS verrà portato alla fase PCR, che inibisce notevolmente l'attività della polimerasi.Pertanto, l'aggiunta dello 0,5% di Tween-20 o Tween-40 alla reazione può neutralizzare gli effetti negativi dell'SDS.
Betaina_
La betaina può migliorare l'amplificazione del DNA riducendo la formazione di strutture secondarie ed è generalmente un'aggiunta "misteriosa" ai kit PCR commerciali.Se si desidera utilizzare la betaina, è necessario inserire betaina o betaina monoidrato (Betaina o Betaina monoidrato), ma non betaina cloridrato (Betaina HCl), regolare a una concentrazione finale di 1-1,7 M.La betaina può anche aiutare a migliorare la specificità perché elimina la dipendenza dalla composizione della coppia di basi della fusione del DNA/denaturazione del DNA.
Additivi per ridurre l'adescamento non specifico
Formammide
La formammide è un additivo per PCR organico comunemente usato.Può combinarsi con il solco maggiore e il solco minore nel DNA, riducendo così la stabilità della doppia elica del DNA principale e abbassando la temperatura di fusione del DNA.La concentrazione di formammide utilizzata negli esperimenti di PCR è solitamente dell'1% -5%.
Tetrametilcloruro d'ammonio( TMAC)
Il cloruro di tetrametilammonio può aumentare la specificità dell'ibridazione (specificità dell'ibridazione) e aumentare la temperatura di fusione del DNA.Pertanto, TMAC può rimuovere l'innesco non specifico e ridurre l'associazione errata di DNA e RNA.Se usiprimer degeneratinella reazione PCR, ricordarsi di aggiungere TMAC, che è comunemente usato ad una concentrazione di 15-100 mM.
Altri additivi comuni
Oltre alle due categorie di additivi sopra menzionati, ci sono molti additivi comuni nelle reazioni PCR, sebbene abbiano funzioni diverse, sono anche molto importanti.
Ione di magnesio
Lo ione magnesio è un cofattore indispensabile (cofattore) della polimerasi, vale a dire, senza ione magnesio, la polimerasi è inattiva.Tuttavia, troppi ioni di magnesio possono anche influenzare l'efficienza della polimerasi.La concentrazione di ioni magnesio in ciascuna reazione PCR varierà.Gli agenti chelanti (come l'EDTA o il citrato), la concentrazione di dNTP e le proteine ​​influenzano tutti la concentrazione di ioni di magnesio.Quindi, se hai problemi con il tuo esperimento PCR, puoi provare a cambiare diverse concentrazioni di ioni magnesio, ad esempio, da 1,0 a 4,0 mM, con un intervallo di 0,5–1 mM nel mezzo.
Vale la pena notare che più cicli di congelamento-scongelamento possono portare alla stratificazione della concentrazione della soluzione di cloruro di magnesio.Pertanto, è necessario dissolverlo completamente prima di ogni utilizzo e mescolarlo bene prima di utilizzarlo.
Albumina di siero bovino(albumina bovina, BSA)
Negli esperimenti di chimica molecolare, l'albumina di siero bovino è un additivo molto comune, specialmente nella digestione con enzimi di restrizione e negli esperimenti di PCR.Nelle reazioni PCR, la BSA è utile per ridurre i contaminanti come i composti fenolici.E si dice anche che possa ridurre l'adesione dei reagenti alla parete della provetta.Nella reazione di PCR, solitamente la concentrazione di BSA aggiunta può raggiungere 0,8 mg/ml.
 
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