Base di progettazione del primer (i problemi del 99% possono essere risolti)
1. Lunghezza del primer: il libro di testo richiede 15-30 bp, di solito circa 20 bp.La condizione effettiva è migliore per essere 18-24bp per garantire la specificità, ma più lungo è il primer migliore, troppo lungo ridurrà anche la specificità e ridurrà la resa.
2. Intervallo di amplificazione del primer: 200-500 bp è appropriato e il frammento può essere espanso a 10 kb in condizioni specifiche.
3. Base di primer: il contenuto di G+C dovrebbe essere del 40-60%, troppo poco effetto di amplificazione G+C non è buono, troppo G+C è facile che appaiano bande non specifiche.ATGC è meglio distribuito in modo casuale, evitando cluster di più di 5 nucleotidi purinici o pirimidinici.Multi-gc per l'estremità 5′ e le sequenze intermedie per aumentare la stabilità, evitare GC ricco all'estremità 3′, nessun GC per le ultime 3 basi o nessun GC per 3 delle ultime 5 basi.
4. Evitare la struttura secondaria nei primer ed evitare la complementazione tra due primer, in particolare la complementazione all'estremità 3', altrimenti si formerà un dimero di primer e verranno generate bande amplificate non specifiche.
5. Le basi all'estremità 3' dei primer, in particolare l'ultima e la penultima base, devono essere rigorosamente accoppiate per evitare il fallimento della PCR a causa di basi terminali non accoppiate.
6. I primer hanno o possono essere aggiunti con siti di scissione appropriati e la sequenza target amplificata dovrebbe preferibilmente avere siti di scissione appropriati, il che è molto vantaggioso per l'analisi di scissione o la clonazione molecolare.
7. Specificità dei primer: i primer non devono avere un'ovvia omologia con altre sequenze nel database delle sequenze degli acidi nucleici.
8. Impara a usare il software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (questo design online funziona meglio).
Il contenuto di cui sopra può risolvere almeno il 99% dei problemi di progettazione del primer.
Controlla i dettagli del design del primer
1. Lunghezza dell'innesco
La lunghezza generale del primer è di 18~30 basi.In generale, il fattore più importante che determina la temperatura di ricottura del primer è la lunghezza del primer.La temperatura di ricottura del primer è generalmente selezionata (valore Tm -5 ℃) e alcuni utilizzano direttamente il valore Tm.Le seguenti formule possono essere utilizzate per calcolare approssimativamente la temperatura di ricottura dei primer.
Quando la lunghezza del primer è inferiore a 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Quando la lunghezza del primer è maggiore di 20 bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/lunghezza-5℃
Inoltre, molti software possono essere utilizzati anche per calcolare la temperatura di ricottura, il principio di calcolo sarà diverso, quindi a volte il valore calcolato potrebbe presentare un piccolo divario.Per ottimizzare le reazioni PCR, vengono utilizzati i primer più corti che garantiscono temperature di ricottura non inferiori a 54℃ per la migliore efficienza e specificità.
Complessivamente, la specificità del primer aumenta di un fattore quattro per ogni nucleotide aggiuntivo, in modo che la lunghezza minima del primer per la maggior parte delle applicazioni sia di 18 nucleotidi.Il limite superiore della lunghezza del primer non è molto importante, principalmente legato all'efficienza della reazione.A causa dell'entropia, più lungo è il primer, minore è la velocità con cui si associa per legarsi al DNA bersaglio per formare uno stampo stabile a doppio filamento per il legame della DNA polimerasi.
Quando si utilizza il software per progettare i primer, la lunghezza dei primer può essere determinata a sua volta dal valore TM, in particolare per i primer della PCR quantitativa a fluorescenza, TM = 60 ℃ o giù di lì dovrebbe essere controllato.
contenuto 2.GC
Generalmente, il contenuto di G+C nelle sequenze di primer è del 40%~60% e il contenuto di GC e il valore Tm di una coppia di primer devono essere coordinati.Se l'innesco ha una seria tendenza GC o AT, è possibile aggiungere una quantità appropriata di coda A, T o G e C all'estremità 5' dell'innesco.
3. Temperatura di ricottura
La temperatura di ricottura dovrebbe essere inferiore di 5 ℃ rispetto alla temperatura di unchain.Se il numero di basi di primer è piccolo, la temperatura di ricottura può essere aumentata in modo appropriato, il che può aumentare la specificità della PCR.Se il numero di basi è elevato, la temperatura di ricottura può essere ridotta in modo appropriato.La differenza di temperatura di ricottura tra una coppia di primer di 4℃ ~ 6℃ non influirà sulla resa della PCR, ma idealmente la temperatura di ricottura di una coppia di primer è la stessa, che può variare tra 55℃ ~ 75℃.
4. Evitare l'area della struttura secondaria del modello di amplificazione
È meglio evitare la regione della struttura secondaria del modello quando si seleziona il frammento amplificato.La struttura secondaria stabile del frammento target può essere prevista e stimata dal relativo software per computer, utile per la selezione del modello.I risultati sperimentali mostrano che l'espansione spesso non ha successo quando l'energia libera (△G) della regione da espandere è inferiore a 58,6 lkJ/mol.
5. Mancata corrispondenza con il DNA bersaglio
Quando la sequenza di DNA bersaglio amplificata è grande, un primer può legarsi a più parti del DNA bersaglio, determinando la comparsa di più bande nel risultato.Questa volta è necessario utilizzare il test del software BLAST, sito web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selezionare Allinea due sequenze (bl2seq).
Incollare sequenze di primer nella zona 1 e sequenze di DNA target nella zona 2 è intercambiabile e BLAST calcola possibilità complementari, antisenso e di altro tipo, quindi gli utenti non devono notare se entrambe le catene sono catene sensoriali.Puoi anche inserire il numero GI se conosci il numero GI della sequenza nel database, quindi non devi incollare una grande sezione della sequenza.Infine, fare clic su Allinea a 3 per vedere se il primer ha più siti omologhi nel DNA bersaglio.
6. Terminale di innesco
L'estremità 3' dell'innesco è il punto in cui inizia l'estensione, quindi è importante evitare che i disallineamenti inizino da lì.L'estremità 3' non dovrebbe essere più di 3 G o C consecutivi, poiché ciò causerebbe l'attivazione errata del primer nella regione della sequenza di arricchimento G+C.L'estremità 3 'non può formare alcuna struttura secondaria, tranne che in speciali reazioni PCR (AS-PCR), l'estremità 3' del primer non può essere disadattata.Ad esempio, se la regione codificante è amplificata, l'estremità 3' del primer non deve essere terminata nella terza posizione del codone, poiché la terza posizione del codone tende a degenerare, il che influenzerà la specificità e l'efficienza dell'amplificazione.Quando si utilizzano primer di annessione, fare riferimento alla tabella di utilizzo del codone, prestare attenzione alle preferenze biologiche, non utilizzare primer di annessione all'estremità 3' e utilizzare una maggiore concentrazione di primer (1uM-3uM).
7. Struttura secondaria dei primer
I primer stessi non dovrebbero avere sequenze complementari, altrimenti i primer stessi si piegheranno in strutture a forcina e questa struttura secondaria influenzerà il legame di primer e modelli a causa dell'impedimento sterico.Se si utilizza il giudizio artificiale, le basi complementari continue dei primer stessi non dovrebbero essere maggiori di 3bp.Non dovrebbe esserci complementarietà tra i due primer, in particolare la sovrapposizione complementare dell'estremità 3' dovrebbe essere evitata per evitare la formazione di dimeri di primer.In generale, non dovrebbero esserci più di 4 basi consecutive di omologia o complementarità tra una coppia di primer.
8. Aggiungere marcatori o loci
L'estremità 5 'ha scarso effetto sulla specificità dell'amplificazione e può quindi essere modificata senza influire sulla specificità dell'amplificazione.La modifica dell'estremità 5 del primer includeva: l'aggiunta del sito di restrizione dell'enzima;Biotina marcata, fluorescenza, digossina, Eu3+, ecc. Introdurre sequenze di DNA che legano proteine;Introdurre siti di mutazione, inserire e mancare sequenze di mutazioni e introdurre sequenze di promotori, ecc. Le basi extra influenzeranno più o meno l'efficienza dell'amplificazione e aumenteranno la possibilità di formazione di dimeri di primer, ma è necessario fare alcune concessioni per il passaggio successivo.Sequenze aggiuntive che non esistono sulla sequenza bersaglio, come i siti di restrizione e le sequenze del promotore, possono essere aggiunte all'estremità 5′ del primer senza influire sulla specificità.Queste sequenze non sono incluse nel calcolo dei valori Tm dei primer, ma dovrebbero essere testate per la complementarità e la struttura secondaria interna.
9. Sottocloni
La maggior parte delle volte, la PCR è solo una clonazione preliminare, quindi dobbiamo sottoclonare il frammento target in vari vettori, quindi dobbiamo progettare basi aggiuntive per l'operazione successiva nella fase della PCR.
Di seguito sono riassunte alcune sequenze progettate per la subclonazione.
È stato aggiunto il sito di restrizione dell'endonucleasi di restrizione
L'aggiunta di siti di restrizione enzimatica è il metodo più comunemente utilizzato per la subclonazione dei prodotti PCR.Generalmente, il sito di scissione è di sei basi, oltre all'estremità 5 'del sito di scissione è necessario aggiungere 2 ~ 3 basi protettive.Tuttavia, il numero di basi protettive richieste da diversi enzimi è diverso.Ad esempio, SalⅠ non richiede alcuna base protettiva, EcoRⅤ richiede 1 base protettiva, NotⅠ richiede 2 basi protettive e Hind Ⅲ richiede 3 basi protettive.
LIC aggiunge la coda
Il nome completo di LIC è Ligation-Independent cloning, un metodo di clonazione inventato da Navogen appositamente per la sua parte del vettore pET.Il vettore pET preparato con il metodo LIC ha estremità adesive a filamento singolo di 12-15 basi non complementari, che completano le estremità adesive corrispondenti sul frammento dell'inserto bersaglio.Ai fini dell'amplificazione, la sequenza del primer 5' del frammento inserito dovrebbe integrare il vettore LIC.L'attività extranect 3′→5′ della DNA polimerasi T4 può formare dopo breve tempo un'estremità appiccicosa a filamento singolo sul frammento inserito.Poiché il prodotto può essere formato solo dalla ricottura reciproca del frammento dell'inserto preparato e del vettore, questo metodo è molto rapido ed efficiente ed è clonazione diretta.
Il clone TA diretto aggiunge la coda
La clonazione TA non è stata in grado di indirizzare il frammento in un vettore, quindi in seguito Invitrogen ha introdotto un vettore in grado di indirizzare la clonazione, che conteneva quattro GTGGS di base prominenti a un'estremità.Pertanto, nella progettazione dei primer PCR, le sequenze complementari dovrebbero essere aggiunte di conseguenza, in modo che i frammenti possano essere "orientati".
Se hai poco tempo, puoi provare la sintesi diretta, combinando il gene con il vettore, che è ciò che chiamiamo sintesi del gene ET nei musecularisti.
D. Metodo di clonazione In-Fusion
Nessuna ligasi richiesta, nessuna lunga reazione richiesta.Finché viene introdotta una sequenza a entrambe le estremità del vettore linearizzato Nella progettazione dei primer, quindi il prodotto PCR e il vettore linearizzato vengono aggiunti nella soluzione enzimatica in fusione contenente BSA e posti a temperatura ambiente per mezz'ora, la trasformazione può essere eseguita.Questo metodo è particolarmente adatto per la conversione di grandi volumi.
10. Unisci primer
A volte, sono note solo informazioni di sequenza limitate sul design del primer.Ad esempio, se è nota solo la sequenza amminoacidica, è possibile progettare il primer di fusione.Un primer di fusione è una miscela di diverse sequenze che rappresentano tutte le diverse possibilità di base che codificano un singolo amminoacido.Per aumentare la specificità, è possibile fare riferimento alla tabella di utilizzo del codone per ridurre l'annessione in base alle preferenze di utilizzo di base dei diversi organismi.L'ipoxantina può essere abbinata a tutte le basi per ridurre la temperatura di ricottura del primer.Non utilizzare le basi annesse all'estremità 3' del primer perché la ricottura delle ultime 3 basi all'estremità 3' è sufficiente per avviare la PCR nel sito sbagliato.Vengono utilizzate concentrazioni di primer più elevate (da 1μM a 3μM) perché i primer in molte miscele di annessione non sono specifici per il modello target.
Materie prime PCRcontrollo
1. Quantità di primer
La concentrazione di ciascun primer è 0,1 ~ 1umol o 10 ~ 100 pmol.È meglio produrre il risultato richiesto con la minor quantità di primer.Un'elevata concentrazione di primer causerà mismatch e amplificazione non specifica e aumenterà la possibilità di formare dimeri tra primer.
2. Concentrazione del primer
La concentrazione di primer influisce sulla specificità.La concentrazione ottimale di primer è generalmente compresa tra 0,1 e 0,5μM.Concentrazioni di primer più elevate portano all'amplificazione di prodotti non specifici.
3. Temperatura di ricottura del primer
Un altro parametro importante per i primer è la temperatura di fusione (Tm).Questa è la temperatura alla quale il 50% dei primer e delle sequenze complementari sono rappresentati come molecole di DNA a doppio filamento.Tm è necessario per impostare la temperatura di ricottura PCR.Idealmente, la temperatura di ricottura è sufficientemente bassa da garantire un'efficace ricottura dei primer con la sequenza target, ma sufficientemente elevata da ridurre il legame non specifico.Temperatura di ricottura ragionevole da 55℃ a 70℃.La temperatura di ricottura è generalmente impostata su 5 ℃ inferiore a Tm del primer.
Esistono diverse formule per impostare Tm, che variano notevolmente a seconda della formula utilizzata e della sequenza dei primer.Poiché la maggior parte delle formule fornisce un valore Tm stimato, tutte le temperature di ricottura sono solo un punto di partenza.La specificità può essere migliorata analizzando diverse reazioni che aumentano progressivamente la temperatura di ricottura.Iniziare al di sotto della Tm-5℃ stimata e aumentare gradualmente la temperatura di ricottura con incrementi di 2℃.Una temperatura di ricottura più elevata ridurrà la formazione di dimeri di primer e prodotti non specifici.Per ottenere i migliori risultati, i due primer dovrebbero avere valori Tm approssimativi.Se la differenza Tm delle coppie di primer è superiore a 5 ℃, i primer mostreranno un significativo falso inizio utilizzando una temperatura di ricottura inferiore nel ciclo.Se i due primer Tm sono diversi, impostare la temperatura di ricottura a 5℃ inferiore alla Tm più bassa.In alternativa, per aumentare la specificità, è possibile eseguire prima cinque cicli a temperature di ricottura progettate per Tm più elevate, seguiti dai restanti cicli a temperature di ricottura progettate per Tm inferiori.Ciò consente di ottenere una copia parziale del modello di destinazione in condizioni rigorose.
4. Purezza e stabilità del primer
La purezza standard dei primer personalizzati è adeguata per la maggior parte delle applicazioni PCR.La rimozione dei gruppi benzoile e isobutilile mediante dissalazione è minima e quindi non interferisce con la PCR.Alcune applicazioni richiedono la purificazione per rimuovere eventuali sequenze non a lunghezza intera nel processo di sintesi.Queste sequenze troncate si verificano perché l'efficienza della chimica di sintesi del DNA non è del 100%.Questo è un processo circolare che utilizza ripetute reazioni chimiche man mano che ogni base viene aggiunta per formare il DNA da 3 ′ a 5 ′.Puoi fallire in entrambi i cicli.I primer più lunghi, in particolare quelli superiori a 50 basi, hanno una grande percentuale di sequenze troncate e possono richiedere la purificazione.
La resa dei primer è influenzata dall'efficienza della chimica sintetica e dal metodo di purificazione.Le aziende biofarmaceutiche, come Cytology e Shengong, utilizzano tutte un'unità OD minima per garantire la produzione totale di oligonucleosidi.I primer personalizzati vengono spediti sotto forma di polvere secca.È meglio sciogliere nuovamente i primer in TE in modo che la concentrazione finale sia di 100μM.TE è migliore dell'acqua deionizzata perché il pH dell'acqua è spesso acido e causerà l'idrolisi degli oligonucleosidi.
La stabilità dei primer dipende dalle condizioni di conservazione.La polvere secca e i primer disciolti devono essere conservati a -20 ℃.I primer disciolti in TE a concentrazioni superiori a 10 μM possono essere conservati stabilmente a -20 ℃ per 6 mesi, ma possono essere conservati solo a temperatura ambiente (da 15 ℃ a 30 ℃) per meno di 1 settimana.I primer in polvere secca possono essere conservati a -20 C per almeno 1 anno ea temperatura ambiente (da 15 C a 30 C) per un massimo di 2 mesi.
5. Enzimi e loro concentrazioni
Attualmente, la Taq DNA polimerasi utilizzata è fondamentalmente l'enzima di ingegneria genetica sintetizzato dai batteri coliformi.La quantità di enzima necessaria per catalizzare una tipica reazione di PCR è di circa 2,5 U (si riferisce al volume totale della reazione di 100 ul).Se la concentrazione è troppo alta, può portare ad un'amplificazione non specifica;se la concentrazione è troppo bassa, la quantità di prodotto sintetico sarà ridotta.
6. Qualità e concentrazione dei dNTP
La qualità del dNTP è strettamente correlata alla concentrazione e all'efficienza dell'amplificazione PCR.La polvere dNTP è granulare e la sua variabilità perde la sua attività biologica se viene conservata in modo improprio.La soluzione dNTP è acida e deve essere utilizzata in alta concentrazione, con soluzione tampone 1M NaOH o 1M Tris.HCL per regolare il suo PH a 7,0 ~ 7,5, piccola quantità di sottoimballaggio, conservazione congelata a -20 ℃.Il congelamento-scongelamento multiplo degraderà il dNTP.Nella reazione PCR, dNTP dovrebbe essere 50 ~ 200umol/L.In particolare, si dovrebbe prestare attenzione alla concentrazione dei quattro DNTPS dovrebbe essere uguale (uguale preparazione talpa).Se la concentrazione di uno di essi è diversa dalle altre (superiore o inferiore), si verificherà un disadattamento.Una concentrazione troppo bassa ridurrà la resa dei prodotti PCR.dNTP può combinarsi con Mg2+ e ridurre la concentrazione di Mg2+ libero.
7. Acido nucleico stampo (gene bersaglio).
La quantità e il grado di purificazione dell'acido nucleico stampo è uno degli anelli chiave per il successo o il fallimento della PCR.I metodi tradizionali di purificazione del DNA di solito utilizzano SDS e proteasi K per digerire e smaltire i campioni.Le funzioni principali dell'SDS sono: dissolvere i lipidi e le proteine sulla membrana cellulare, distruggendo così la membrana cellulare dissolvendo le proteine di membrana e dissociando le proteine nucleari nella cellula, l'SDS può anche combinarsi con le proteine e precipitare;La proteasi K può idrolizzare e digerire le proteine, in particolare gli istoni legati al DNA, quindi utilizzare il solvente organico fenolo e cloroformio per estrarre proteine e altri componenti cellulari e utilizzare etanolo o alcool isopropilico per precipitare l'acido nucleico.L'acido nucleico estratto può essere utilizzato come modello per le reazioni di PCR.Per i campioni di rilevamento clinico generale, è possibile utilizzare un metodo rapido e semplice per dissolvere le cellule, lisare i patogeni, digerire e rimuovere le proteine dai cromosomi per liberare i geni bersaglio e utilizzarlo direttamente per l'amplificazione PCR.L'estrazione del modello di RNA di solito utilizza il metodo dell'isotiocianato di guanidina o della proteasi K per impedire all'RNasi di degradare l'RNA.
8.Mg2+ concentrazione
Mg2+ ha un effetto significativo sulla specificità e sulla resa dell'amplificazione PCR.Nella reazione PCR generale, quando la concentrazione di vari dNTP è 200umol/L, la concentrazione appropriata di Mg2+ è 1,5 ~ 2,0mmol/L.La concentrazione di Mg2+ è troppo elevata, la specificità della reazione diminuisce, si verifica un'amplificazione non specifica, una concentrazione troppo bassa ridurrà l'attività della Taq DNA polimerasi, con conseguente riduzione dei prodotti di reazione.
Gli ioni di magnesio influenzano diversi aspetti della PCR, come l'attività della DNA polimerasi, che influisce sulla resa;Un altro esempio è la ricottura del primer, che influisce sulla specificità.dNTP e stampo si legano allo ione magnesio, riducendo la quantità di ione magnesio libero necessaria per l'attività enzimatica.La concentrazione ottimale di ioni di magnesio varia per diverse coppie di primer e modelli, ma una tipica concentrazione iniziale di PCR con 200μM dNTP è di 1,5 mM (nota: per la PCR quantitativa in tempo reale, utilizzare una soluzione di ioni di magnesio da 3 a 5 mM con una sonda fluorescente).Concentrazioni più elevate di ioni di magnesio liberi aumentano la resa, ma aumentano anche l'amplificazione non specifica e diminuiscono la fedeltà.Per determinare la concentrazione ottimale, sono state eseguite titolazioni di ioni di magnesio con incrementi di 0,5 mM da 1 mM a 3 mM.Per ridurre la dipendenza dall'ottimizzazione degli ioni di magnesio, è possibile utilizzare la Platinum Taq DNA polimerasi.La Platinum Taq DNA polimerasi è in grado di mantenere la funzione su una gamma più ampia di concentrazioni di ioni di magnesio rispetto alla Taq DNA polimerasi e pertanto richiede una minore ottimizzazione.
9. Additivi promotori di PCr
L'ottimizzazione della temperatura di ricottura, del design del primer e della concentrazione di ioni magnesio è sufficiente per un'amplificazione altamente specifica della maggior parte dei modelli;tuttavia, alcuni modelli, compresi quelli con elevato contenuto di GC, richiedono misure aggiuntive.Gli additivi che influenzano la temperatura di fusione del DNA forniscono un altro modo per migliorare la specificità e la resa del prodotto.Per ottenere i migliori risultati è necessaria la completa denaturazione del modello.
Inoltre, la struttura secondaria impedisce il legame del primer e l'estensione dell'enzima.
Gli additivi per PCR, tra cui formammide, DMSO, glicerina, betaina e PCRx Enhancer Solution, migliorano l'amplificazione.Il loro possibile meccanismo è quello di ridurre la temperatura di fusione, favorendo così la ricottura dei primer e favorendo l'estensione della DNA polimerasi attraverso la regione della struttura secondaria.La soluzione PCRx ha altri vantaggi.È necessaria un'ottimizzazione minima degli ioni di magnesio se utilizzata con Platinum Taq DNA polimerasi e Platinum Pfx DNA polimerasi.Pertanto, la tecnica del platino è combinata con l'additivo per aumentare la specificità riducendo al contempo la dipendenza del terzo approccio, l'ottimizzazione dello ione magnesio.Per ottenere i migliori risultati, la concentrazione degli additivi dovrebbe essere ottimizzata, in particolare DMSO, formammide e glicerolo, che inibiscono la Taq DNA polimerasi.
10. Avvio a caldo
La PCR con avvio a caldo è uno dei metodi più importanti per migliorare la specificità della PCR oltre a una buona progettazione dei primer.Sebbene la temperatura ottimale di allungamento della Taq DNA polimerasi sia di 72 ℃, la polimerasi rimane attiva a temperatura ambiente.Pertanto, i prodotti non specifici vengono prodotti quando la temperatura di mantenimento è inferiore alla temperatura di ricottura durante la preparazione della reazione PCR e all'inizio del ciclo termico.Una volta formati, questi prodotti non specifici vengono efficacemente amplificati.La PCR hot-start è particolarmente efficace quando i siti utilizzati per la progettazione dei primer sono limitati dalla posizione di elementi genetici, come mutazioni sito-dirette, clonazione di espressioni o costruzione e manipolazione di elementi genetici utilizzati per l'ingegneria del DNA.
Un metodo comune per limitare l'attività della Taq DNA polimerasi consiste nel preparare la soluzione di reazione PCR su ghiaccio e collocarla in un apparato PCR preriscaldato.Questo metodo è semplice ed economico, ma non completa l'attività dell'enzima e quindi non elimina completamente l'amplificazione di prodotti non specifici.
L'adescamento termico ritarda la sintesi del DNA inibendo un componente essenziale finché l'apparato PCR non raggiunge la temperatura di denaturazione.La maggior parte dei metodi di iniziazione termica manuale, inclusa l'aggiunta ritardata di Taq DNA polimerasi, sono scomodi, specialmente per applicazioni ad alto rendimento.Altri metodi di adescamento termico utilizzano uno scudo di cera per racchiudere un componente essenziale, inclusi ioni di magnesio o enzimi, o per isolare fisicamente componenti reattivi, come stampi e tamponi.Durante il ciclo termico, i vari componenti vengono rilasciati e mescolati tra loro man mano che la cera si scioglie.Come il metodo di avvio a caldo manuale, il metodo dello scudo di cera è ingombrante e soggetto a contaminazione e non è adatto per applicazioni ad alta produttività.
La DNA polimerasi di platino è conveniente ed efficiente per la PCR automatica con avvio a caldo.La Taq DNA polimerasi di platino è costituita da Taq DNA polimerasi ricombinante combinata con un anticorpo monoclonale contro la Taq DNA polimerasi.Gli anticorpi sono formulati mediante PCR per inibire l'attività enzimatica durante il mantenimento prolungato della temperatura.La Taq DNA polimerasi è stata rilasciata nella reazione durante l'isolamento a 94°C della fase di denaturazione, ripristinando la piena attività della polimerasi.Contrariamente alla Taq DNA polimerasi modificata chimicamente per l'iniziazione termica, l'enzima platino non richiede un isolamento prolungato a 94℃ (da 10 a 15 minuti) per attivare la polimerasi.Con PlatinumTaq DNA polimerasi, il 90% dell'attività della Taq DNA polimerasi è stato ripristinato dopo 2 minuti a 94°C.
11. Nest-PCR
Successivi cicli di amplificazione utilizzando primer nidificati possono migliorare la specificità e la sensibilità.Il primo round è un'amplificazione standard da 15 a 20 cicli.Una piccola frazione del prodotto di amplificazione iniziale è stata diluita da 100 a 1000 volte e aggiunta al secondo ciclo di amplificazione per 15-20 cicli.In alternativa, il prodotto amplificato iniziale può essere dimensionato mediante purificazione su gel.Un primer annidato viene utilizzato nel secondo ciclo di amplificazione, che può legarsi alla sequenza target all'interno del primo primer.L'uso della PCR nidificata riduce la possibilità di amplificazione di più siti target perché ci sono poche sequenze target complementari a entrambi i set di primer.Lo stesso numero totale di cicli (da 30 a 40) con gli stessi primer ha amplificato i siti non specifici.La PCR nidificata aumenta la sensibilità di sequenze target limitate (ad es. mrna rari) e migliora la specificità di PCRS difficili (ad es. 5′ RACE).
12. PCR discendente
La PCR discendente migliora la specificità utilizzando condizioni di tight annealing per i primi cicli di PCR.Il ciclo inizia a una temperatura di ricottura di circa 5 ℃ superiore alla Tm stimata, quindi ogni ciclo viene ridotto di 1 ℃ a 2 ℃ fino a quando la temperatura di ricottura è inferiore a Tm 5 ℃.Verrà amplificato solo il modello di destinazione con la massima omologia.Questi prodotti continuano ad espandersi nei cicli successivi, spiazzando i prodotti non specifici amplificati.La PCR discendente è utile per i metodi in cui non è noto il grado di omologia tra primer e templato target, come il fingerprinting del DNA AFLP.
Kit PCR correlati
L'eroe 2 × PCRTMIl sistema Mix ha una maggiore tolleranza agli inibitori della PCR rispetto al normale sistema PCR Mix e può facilmente far fronte all'amplificazione PCR di vari modelli complessi.L'esclusivo sistema di reazione e Taq Hero ad alta efficienza fanno sì che la reazione PCR abbia una maggiore efficienza di amplificazione, specificità e sensibilità.
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Ha attività 5'→3' DNA polimerasi e attività 5'→3' esonucleasi, senza attività 3'→5' esonucleasi.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifico: il tampone ottimizzato e l'enzima Taq hot-start possono prevenire l'amplificazione non specifica e la formazione di dimeri di primer
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Tempo di pubblicazione: maggio-09-2023
