La caratteristica eccezionale della reazione PCR è la sua grande capacità di amplificazione e la sensibilità estremamente elevata.Al fine di migliorare le prestazioni della PCR e l'efficienza di rilevamento, ci impegniamo a migliorare la capacità di amplificazione della PCR e la sensibilità di rilevamento, ma il mal di testa è nel corso dell'esperimento.Spesso si verificano falsi positivi e una quantità molto piccola di contaminazione incrociata del campione o contaminazione del prodotto PCR può causare falsi positivi nell'esperimento.
Cinque tipi di contaminazione del prodotto PCR
Ci sono molte ragioni per la contaminazione da PCR, che possono essere approssimativamente suddivise nelle seguenti categorie:
La contaminazione del campione è causata principalmente dalla contaminazione del contenitore per la raccolta del campione, o quando il campione viene posizionato, è fuoriuscito dal contenitore a causa della chiusura allentata, oppure il campione è aderito all'esterno del contenitore, che provoca contaminazione incrociata;La contaminazione porta alla contaminazione tra i campioni;alcuni campioni microbici, in particolare i virus, possono diffondersi con aerosol o formare aerosol, provocando una reciproca contaminazione.
Il motivo principale è che durante la preparazione dei reagenti PCR, la pistola campione, il contenitore, l'acqua bidistillata e altre soluzioni sono contaminati dal modello di acido nucleico PCR.
Nei laboratori di biologia molecolare e in alcuni laboratori che utilizzano plasmidi clonati come controlli positivi, è comune anche il problema della contaminazione da plasmidi clonati.Poiché il contenuto di clonazione del plasmide nel volume unitario è piuttosto elevato e nel processo di purificazione sono necessari più strumenti e reagenti, è molto probabile che il plasmide nelle cellule viventi sia contaminato a causa della forte capacità di crescita e riproduzione delle cellule viventi.
La contaminazione dei prodotti amplificati è il problema di contaminazione più comune nelle reazioni di PCR.Poiché la quantità di copie del prodotto PCR è elevata (generalmente 1013 copie/ml), che è di gran lunga superiore al limite del numero di copie di rilevamento PCR, una quantità molto piccola di contaminazione del prodotto PCR può causare falsi positivi.
L'inquinamento da aerosol è la forma più probabile di contaminazione dei prodotti PCR ed è anche la più facile da trascurare.È formato dall'attrito tra la superficie del liquido e l'aria.Generalmente, la contaminazione da aerosol può formarsi quando il coperchio viene aperto, quando il campione viene aspirato, o anche quando il tubo di reazione viene agitato vigorosamente.Secondo i calcoli, una particella di aerosol può contenere 48.000 copie, quindi l'inquinamento da essa causato è un problema che merita un'attenzione particolare.
In particolare, i laboratori di test utilizzano spesso la stessa coppia di primer per testare un determinato gene.Nel corso del tempo, nello spazio del laboratorio si verificherà una grande quantità di contaminazione del prodotto PCR.Una volta che si verifica tale contaminazione, è difficile eliminarla in breve tempo.
Per i primi tre tipi di inquinamento, possiamo utilizzare mezzi efficaci per evitare, ma l'inquinamento causato dai prodotti PCR è difficile da prevenire, soprattutto nella costruzione di laboratori PCR non standard.Nel processo PCR, quando la punta della pipetta aspira e soffia il liquido e il coperchio della provetta PCR viene aperto, si formerà un aerosol.Le molecole di DNA trasportate dall'aerosol (un aerosol può trasportare decine di migliaia di DNA) sono difficili da eliminare perché fluttuano nell'aria.Una volta introdotto il prossimo ciclo di esperimenti PCR, si verificheranno inevitabilmente falsi positivi.
Come mostrato nella figura seguente, il controllo negativo ha anche amplificato la corrispondente banda di interesse:
La prima parte di questo numero sull'inquinamento e la prevenzione della PCR è introdotta qui.Il prossimo numero vi porterà la seconda parte "Prevenzione della contaminazione da prodotti PCR", quindi rimanete sintonizzati!
Tempo di pubblicazione: luglio-25-2017
