La perdita dell'udito (HL) è la malattia di disabilità sensoriale più comune negli esseri umani.Nei paesi sviluppati, circa l'80% dei casi di sordità prelinguale nei bambini è causato da fattori genetici.I più comuni sono i difetti di un singolo gene (come mostrato in Fig. 1), 124 mutazioni genetiche sono state associate a ipoacusia non sindromica nell'uomo, il resto è causato da fattori ambientali.Un impianto cocleare (un dispositivo elettronico posizionato nell'orecchio interno che fornisce stimolazione elettrica direttamente al nervo uditivo) è di gran lunga l'opzione più efficace per il trattamento dell'HL grave, mentre un apparecchio acustico (un dispositivo elettronico esterno che converte e amplifica le onde sonore) può aiutare i pazienti con HL moderato.Tuttavia, attualmente non sono disponibili farmaci per il trattamento dell'HL ereditario (GHL).Negli ultimi anni, la terapia genica ha ricevuto una crescente attenzione come approccio promettente per il trattamento della disfunzione dell'orecchio interno.

Fig. 1.Distribuzione del tipo di variazione associata alla sordità.[1]

Recentemente, gli scienziati del Salk Institute e dell'Università di Sheffield hanno pubblicato un risultato di ricerca su Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], che ha mostrato ampie prospettive di applicazione per la terapia genica in vivo della sordità ereditaria.Uri Manor, assistente professore di ricerca presso il Salk Institute e direttore del Waitt Center for Advanced Biophotonics, ha affermato di essere nato con una grave perdita dell'udito e ha ritenuto che ripristinare l'udito sarebbe stato un dono meraviglioso.La sua precedente ricerca ha scoperto che Eps8 è una proteina regolatrice dell'actina con attività di legame e capping dell'actina;nelle cellule ciliate cocleari, il complesso proteico formato da Eps8 con MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 e GNAI3 esiste principalmente nella maggior parte delle sterociglia.Pertanto, Eps8 può regolare la lunghezza della stereocilia delle cellule ciliate, che è essenziale per la normale funzione uditiva;La delezione o la mutazione di Eps8 porterà a stereociglia corte, che lo rendono incapace di convertire correttamente il suono in segnali elettrici per la percezione del cervello, che a sua volta porta alla sordità..Allo stesso tempo, il collaboratore Walter Marcotti, professore all'Università di Sheffield, ha scoperto che le cellule ciliate non possono svilupparsi normalmente in assenza di Eps8.In questo studio, Manor e Marcotti hanno collaborato per verificare se l'aggiunta di Eps8 alle cellule stereociliari potesse ripristinare la loro funzione e, a sua volta, migliorare l'udito nei topi.Il team di ricerca ha utilizzato il vettore del virus adeno-associato (AAV) Anc80L65 per fornire la sequenza codificante contenente EPS8 wild-type nella coclea di topi P1-P2 neonati Eps8-/- mediante iniezione nella membrana della finestra rotonda;nelle cellule ciliate cocleari di topo La funzione delle stereociglia è stata riparata prima che maturassero;e l'effetto di riparazione è stato caratterizzato dalla tecnologia di imaging e dalla misurazione della stereocilia.I risultati hanno mostrato che Eps8 ha aumentato la lunghezza delle stereociglia e ripristinato la funzione delle cellule ciliate nelle cellule a bassa frequenza.Hanno anche scoperto che, nel tempo, le cellule sembravano perdere la capacità di essere salvate da questa terapia genica.L'implicazione è che questo trattamento potrebbe dover essere somministrato in utero, poiché le cellule ciliate Eps8-/- potrebbero essere maturate o aver accumulato danni irreparabili dopo la nascita dei topi."Eps8 è una proteina con molte funzioni diverse, e c'è ancora molto da esplorare", ha detto Manor.La ricerca futura includerà lo studio dell'effetto della terapia genica Eps8 nel ripristino dell'udito in diversi stadi di sviluppo e se sia possibile prolungare le opportunità di trattamento.Per coincidenza, nel novembre 2020, il professor KarenB Avraham dell'Università di Tel Aviv in Israele ha pubblicato i suoi risultati sulla rivista EMBO Molecular Medicine [3], utilizzando un'innovativa tecnologia di terapia genica per creare un innocuo virus adeno-associato sintetico AAV9-PHP.B, Il difetto genetico nelle cellule ciliate dei topi Syne4-/- è stato riparato iniettando un virus che trasporta la sequenza codificante di Syne4 nell'orecchio interno dei topi, consentendogli di entrare nelle cellule ciliate e rilasciare il materiale genetico trasportato, consentendo loro di maturare e funzionare normalmente (come in Fig. 2).

Fig2.Rappresentazione schematica dell'anatomia dell'orecchio interno, con particolare attenzione all'organo del Corti e alla funzione cellulare del nesprin-4.

Si può vedere che l'uso della terapia genica per raggiungere lo scopo di trattare le malattie ereditarie a livello genico inserendo, rimuovendo o correggendo eventuali geni mutati per il trattamento (cioè controllando i cambiamenti genetici nella malattia) ha un elevato effetto clinico.prospettive applicative.Gli attuali metodi di terapia genica per la sordità geneticamente carente possono essere suddivisi nelle seguenti categorie:

sostituzione genica

La sostituzione genica è probabilmente la forma più "semplice" di terapia genica, basata sull'identificazione e la sostituzione di un gene difettoso con una copia normale o wild-type del gene.Primo studio riuscito sulla terapia genica dell'orecchio interno per la perdita dell'udito causata dalla delezione del gene del trasportatore vescicolare del glutammato 3 (VGLUT3);La consegna mediata da AAV1 della sovraespressione esogena di VGLUT3 nelle cellule ciliate dell'orecchio interno (IHC) può provocare un recupero dell'udito sostenuto, un parziale recupero della morfologia sinaptica del nastro e risposte convulsive [4].Tuttavia, negli esempi che includono le due sostituzioni geniche fornite da AAV descritte nell'introduzione di cui sopra, è importante notare che i modelli murini utilizzati per alcuni tipi di disturbi ereditari dell'ipoacusia con delezione genica sono temporalmente diversi dagli esseri umani e nei topi P1, l'orecchio interno è nella fase matura dello sviluppo.Al contrario, gli esseri umani nascono con un orecchio interno maturo.Questa differenza impedisce la possibile applicazione dei risultati del topo al trattamento dei disturbi della sordità ereditaria umana a meno che la terapia genica non venga somministrata alle orecchie di topo maturo.

Modifica genica: CRISPR/Cas9

Rispetto alla "sostituzione genica", lo sviluppo della tecnologia di editing genetico ha portato all'alba del trattamento delle malattie genetiche dalla radice.È importante sottolineare che il metodo di editing genetico compensa le carenze dei tradizionali metodi di terapia genica di sovraespressione che non sono adatti per le malattie della sordità ereditaria dominante e il problema che il metodo di sovraespressione non dura a lungo.Dopo che i ricercatori cinesi hanno specificamente eliminato l'allele mutante Myo6C442Y nei topi Myo6WT/C442Y utilizzando il sistema di modifica genica AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, ed entro 5 mesi dal knockout, la funzione uditiva del modello è stata ripristinata;allo stesso tempo, è stato anche osservato che il tasso di sopravvivenza delle cellule ciliate nell'orecchio interno è migliorato, la forma delle ciglia è diventata regolare e gli indicatori elettrofisiologici sono stati corretti [5].Questo è il primo studio al mondo ad utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per il trattamento della sordità ereditaria causata dalla mutazione del gene Myo6, ed è un importante progresso della ricerca della tecnologia di editing genetico per il trattamento della sordità ereditaria.La traduzione clinica del trattamento fornisce una solida base scientifica.

Metodi di somministrazione della terapia genica

Affinché la terapia genica abbia successo, le molecole di DNA nudo non possono penetrare efficacemente nelle cellule a causa della loro idrofilia e della carica negativa dei gruppi fosfato e per garantire l'integrità delle molecole di acido nucleico integrate, è necessario selezionare un metodo sicuro ed efficace.Il DNA integrato viene consegnato alla cellula o al tessuto bersaglio.L'AAV è ampiamente utilizzato come veicolo di consegna per il trattamento delle malattie grazie al suo elevato effetto infettivo, bassa immunogenicità e ampio tropismo a vari tipi di tessuto.Al momento, un ampio corpus di lavori di ricerca ha determinato il tropismo di diversi sottotipi di AAV rispetto a diversi tipi di cellule nella coclea del topo.L'utilizzo delle caratteristiche di consegna AAV combinate con promotori specifici delle cellule può ottenere un'espressione specifica delle cellule, che può ridurre gli effetti fuori bersaglio.Inoltre, in alternativa ai vettori AAV tradizionali, vengono costantemente sviluppati nuovi vettori AAV sintetici che mostrano una capacità di trasduzione superiore nell'orecchio interno, di cui AAV2/Anc80L65 è il più utilizzato.I metodi di consegna non virali possono essere ulteriormente suddivisi in metodi fisici (microiniezione ed elettroporazione) e metodi chimici (nanoparticelle a base di lipidi, polimeri e oro).Entrambi gli approcci sono stati utilizzati nel trattamento dei disturbi ereditari della sordità e hanno mostrato diversi vantaggi e limiti.Oltre al veicolo di consegna per la terapia genica come veicolo, è possibile impiegare diversi approcci per la somministrazione di geni in vivo basati su diversi tipi di cellule bersaglio, vie di somministrazione ed efficacia terapeutica.L'intricata struttura dell'orecchio interno rende difficile raggiungere le cellule bersaglio e la distribuzione degli agenti di modifica del genoma è lenta.Il labirinto membranoso si trova all'interno del labirinto osseo dell'osso temporale e comprende il dotto cocleare, il dotto semicircolare, l'otricolo e il palloncino.Il suo relativo isolamento, la minima circolazione linfatica e la separazione dal sangue da parte di una barriera di sangue-labirinto limitano l'efficace somministrazione sistemica di terapie solo ai topi neonati.Per ottenere titoli virali adatti alla terapia genica, è necessaria l'iniezione locale diretta di vettori virali nell'orecchio interno.Le vie di iniezione stabilite includono [6]: (1) membrana della finestra rotonda (RWM), (2) tracheostomia, (3) cocleostomia endolinfatica o perilinfatica, (4) membrana della finestra rotonda più fenestrazione del tubo (CF) (come in Fig. 3).

Fig3.Erogazione dell'orecchio interno della terapia genica.

Sebbene siano stati compiuti molti progressi nella terapia genica, sulla base di obiettivi traslazionali clinici, è necessario fare ancora più lavoro prima che la terapia genica possa diventare un'opzione terapeutica di prima linea per i pazienti con malattie genetiche, in particolare nello sviluppo di vettori e metodi di somministrazione sicuri ed efficaci.Ma crediamo che nel prossimo futuro questi tipi di trattamenti diventeranno un punto fermo della terapia personalizzata e avranno un impatto enormemente positivo sulla vita delle persone con malattie genetiche e delle loro famiglie.

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