La PCR in tempo reale, nota anche come PCR quantitativa o qPCR, è un metodo per il monitoraggio e l'analisi in tempo reale dei prodotti di amplificazione della PCR.
Poiché la PCR quantitativa presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, veloce e conveniente, alta sensibilità, buona ripetibilità e basso tasso di contaminazione, è ampiamente utilizzata nei test medici, nella valutazione dell'efficacia dei farmaci, nella ricerca sull'espressione genica, nella ricerca transgenica, nel rilevamento genico, nel rilevamento di agenti patogeni, nel rilevamento di animali e piante., test sugli alimenti e altri campi.
Pertanto, che tu sia impegnato nella ricerca di base nelle scienze della vita, o dipendenti di aziende farmaceutiche, aziende zootecniche, aziende alimentari o anche dipendenti di uffici di ispezione e quarantena di ingresso-uscita, dipartimenti di monitoraggio ambientale, ospedali e altre unità, sarai più o meno esposto a O devi conoscere la conoscenza della padronanza della PCR quantitativa.

Principio della Real Time PCR

Real Time PCR è un metodo in cui vengono aggiunte sostanze fluorescenti al sistema di reazione PCR e l'intensità del segnale di fluorescenza nel processo di reazione PCR viene monitorata in tempo reale da uno strumento PCR quantitativo e infine i dati sperimentali vengono analizzati ed elaborati.

【Curva di amplificazione】è la curva che descrive il processo dinamico della PCR.La curva di amplificazione della PCR non è in realtà una curva esponenziale standard, ma una curva sigmoidea.

[Fase della piattaforma della curva di amplificazione]Con l'aumento del numero di cicli di PCR, l'inattivazione della DNA polimerasi, l'esaurimento dei dNTP e dei primer e l'inibizione della reazione di sintesi da parte del sottoprodotto della reazione pirofosfato, ecc., la PCR non si espande sempre in modo esponenziale., e alla fine entrerà in un plateau.

[Regione di crescita esponenziale della curva di amplificazione]Sebbene la fase di plateau vari notevolmente, in una certa regione della regione di crescita esponenziale della curva di amplificazione, la ripetibilità è molto buona, il che è molto importante per l'analisi quantitativa della PCR.

[Valore di soglia e valore Ct]Impostiamo il valore limite del rilevamento della fluorescenza nella posizione appropriata nell'area di crescita esponenziale della curva di amplificazione, vale a dire il valore di soglia (Threshold).L'intersezione del valore di soglia e della curva di amplificazione è il valore Ct, ovvero il valore Ct si riferisce al numero di cicli (Threshold Cycle) in cui viene raggiunto il valore di soglia.

Il grafico sottostante mostra chiaramente la relazione tra linea di soglia e curva di amplificazione, soglia e valore Ct.

【Come quantificare?】

È stato dimostrato dalla teoria matematica che il valore Ct ha una relazione lineare inversa con il logaritmo del numero di modelli iniziali.Real Time PCR monitora in tempo reale i prodotti dell'amplificazione della PCR e li quantifica durante la fase di amplificazione esponenziale.

Per ogni ciclo di PCR, il DNA è aumentato esponenzialmente di 2 volte e presto ha raggiunto un plateau.

Supponendo che la quantità di DNA iniziale sia A₀ , dopo n cicli, la quantità teorica di DNA prodotto può essere espressa come:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Quindi, maggiore è la quantità iniziale di DNA A 0, prima la quantità del prodotto amplificato raggiunge il valore di rilevamento An e il numero di cicli quando raggiunge An è il valore Ct.Cioè, maggiore è la quantità iniziale di DNA A 0, prima i picchi della curva di amplificazione, e corrispondentemente il numero richiesto di cicli n è minore.

Effettuiamo la diluizione in gradiente dello standard di concentrazione nota e lo usiamo come templato per la Real Time PCR, e una serie di curve di amplificazione saranno ottenute ad intervalli uguali nell'ordine della quantità iniziale di DNA da più a meno.Secondo la relazione lineare tra il valore Ct e il logaritmo del numero di modelli di partenza, a[curva standard] può essere creata .

Sostituendo il valore Ct del campione con concentrazione sconosciuta nella curva standard, è possibile ottenere la quantità di templato iniziale del campione con concentrazione sconosciuta, che è il principio quantitativo della Real Time PCR.

Metodo di rilevamento della Real Time PCR

La PCR in tempo reale rileva i prodotti di amplificazione della PCR rilevando l'intensità della fluorescenza nel sistema di reazione.

Principio del metodo di inclusione del colorante fluorescente】

Coloranti fluorescenti, come TB Green ® , può legarsi in modo non specifico al DNA a doppio filamento nei sistemi PCR e fluorescenza dopo il legame.

L'intensità della fluorescenza nel sistema di reazione è aumentata in modo esponenziale con l'aumento dei cicli di PCR.Rilevando l'intensità della fluorescenza, la quantità di amplificazione del DNA nel sistema di reazione può essere monitorata in tempo reale e quindi la quantità del templato iniziale nel campione può essere stimata in modo inverso.

【Principio del metodo della sonda fluorescente】

sonda fluorescenteè una sequenza di acido nucleico con un gruppo fluorescente all'estremità 5' e un gruppo di spegnimento all'estremità 3', che può legarsi specificamente allo stampo.Quando la sonda è intatta, la fluorescenza emessa dal fluoroforo viene spenta dal gruppo di spegnimento e non può emettere fluorescenza.Quando la sonda viene decomposta, la sostanza fluorescente si dissocerà ed emetterà fluorescenza.

Una sonda fluorescente viene aggiunta alla soluzione di reazione PCR.Durante il processo di ricottura, la sonda fluorescente si legherà alla posizione specifica del modello.Durante il processo di estensione, l'attività esonucleasica 5′ → 3′ dell'enzima PCR può decomporre la sonda fluorescente ibridata con il modello e la sostanza fluorescente viene dissociata per emettere fluorescenza.Rilevando l'intensità di fluorescenza della sonda nel sistema di reazione, è possibile ottenere lo scopo di monitorare la quantità di amplificazione del prodotto PCR.

【Selezione del metodo di rilevamento della fluorescenza】

Se viene utilizzato per distinguere sequenze con elevata omologia ed eseguire il rilevamento PCR multiplex come l'analisi di tipizzazione SNP, il metodo della sonda fluorescente è insostituibile.
Per altri esperimenti di PCR in tempo reale, è possibile utilizzare un metodo di chimera fluorescente semplice, facile ea basso costo.

sonde Forte specificità, in grado di PCR multiplex

Discordanza

Elevati requisiti di specificità per l'amplificazione;

la PCR multiplex non può essere eseguita Necessità di progettare sonde specifiche, costo elevato;

a volte il design della sonda è difficile

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