Nessun segnale di amplificazione

1.La Taq DNA polimerasi nel kit perde la sua attività a causa di una conservazione impropria o della scadenza del kit.
Raccomandazione: confermare le condizioni di conservazione del kit;aggiungere nuovamente una quantità appropriata di Taq DNA Polymerase al sistema PCR o acquistare un nuovo kit Real Time PCR per esperimenti correlati.

2. Ci sono molti inibitori della Taq DNA polimerasi nel modello di DNA.
Suggerimento: purificare nuovamente il modello o ridurre la quantità di modello utilizzato.

3.La concentrazione di Mg2+ non è adatta.
Raccomandazione: la concentrazione di Mg2+ della miscela 2× Real PCR che forniamo è di 3,5 mM.Tuttavia, per alcuni primer e templati speciali, la concentrazione di Mg2+ può essere più elevata.Pertanto, è possibile aggiungere direttamente MgCl2 per ottimizzare la concentrazione di Mg2+.Si consiglia di aumentare ogni volta Mg2+ 0,5 mM per l'ottimizzazione.

4. Le condizioni di amplificazione PCR non sono idonee e la sequenza o la concentrazione del primer non è corretta.
Suggerimento: confermare la correttezza della sequenza del primer e il primer non è stato degradato;se il segnale di amplificazione non è buono, provare ad abbassare la temperatura di ricottura e regolare opportunamente la concentrazione del primer.

5. La quantità di modello è troppo piccola o eccessiva.
Raccomandazione: eseguire la diluizione del gradiente di linearizzazione del modello e selezionare la concentrazione del modello con il miglior effetto PCR per l'esperimento PCR in tempo reale.

NTC ha un valore di fluorescenza troppo alto

1. Contaminazione del reagente causata durante il funzionamento.
Raccomandazione: sostituire con nuovi reagenti per esperimenti PCR in tempo reale.

2.Contaminazione verificatasi durante la preparazione del sistema di reazione PCR.
Raccomandazione: adottare le necessarie misure protettive durante il funzionamento, come ad esempio: indossare guanti in lattice, utilizzare un puntale per pipetta con filtro, ecc.

3.I primer sono degradati e la degradazione dei primer causerà un'amplificazione non specifica.
Suggerimento: utilizzare l'elettroforesi SDS-PAGE per rilevare se i primer sono degradati e sostituirli con nuovi primer per esperimenti di PCR in tempo reale.

Primer dimero o amplificazione non specifica

1.La concentrazione di Mg2+ non è adatta.
Raccomandazione: la concentrazione di Mg2+ della miscela 2× Real PCR EasyTM che forniamo è di 3,5 mM.Tuttavia, per alcuni primer e templati speciali, la concentrazione di Mg2+ può essere più elevata.Pertanto, è possibile aggiungere direttamente MgCl2 per ottimizzare la concentrazione di Mg2+.Si consiglia di aumentare ogni volta Mg2+ 0,5 mM per l'ottimizzazione.

2.La temperatura di ricottura PCR è troppo bassa.
Suggerimento: aumentare la temperatura di ricottura PCR di 1℃ o 2℃ ogni volta.

3.Il prodotto PCR è troppo lungo.
Raccomandazione: la lunghezza del prodotto Real Time PCR deve essere compresa tra 100 e 150 bp, non superiore a 500 bp.

4.I primer sono degradati e la degradazione dei primer porterà alla comparsa di un'amplificazione specifica.
Suggerimento: utilizzare l'elettroforesi SDS-PAGE per rilevare se i primer sono degradati e sostituirli con nuovi primer per esperimenti di PCR in tempo reale.

5.Il sistema PCR non è corretto o il sistema è troppo piccolo.
Suggerimento: se il sistema di reazione PCR è troppo piccolo, la precisione del rilevamento diminuirà.È preferibile utilizzare il sistema di reazione consigliato dallo strumento PCR quantitativo per eseguire nuovamente l'esperimento PCR in tempo reale.

Scarsa ripetibilità dei valori quantitativi

1.Lo strumento non funziona correttamente.
Suggerimento: potrebbero esserci errori tra ciascun foro PCR dello strumento, con conseguente scarsa riproducibilità durante la gestione o il rilevamento della temperatura.Si prega di controllare secondo le istruzioni dello strumento corrispondente.

2. La purezza del campione non è buona.
Raccomandazione: i campioni impuri porteranno a una scarsa riproducibilità dell'esperimento, che include la purezza del modello e dei primer.È meglio purificare nuovamente il modello e i primer vengono purificati al meglio da SDS-PAGE.

3. Il tempo di preparazione e conservazione del sistema PCR è troppo lungo.
Suggerimento: utilizzare il sistema PCR in tempo reale per l'esperimento PCR subito dopo la preparazione e non lasciarlo da parte per troppo tempo.

4. Le condizioni di amplificazione PCR non sono idonee e la sequenza o la concentrazione del primer non è corretta.
Suggerimento: confermare la correttezza della sequenza del primer e il primer non è stato degradato;se il segnale di amplificazione non è buono, provare ad abbassare la temperatura di ricottura e regolare opportunamente la concentrazione del primer.

5.Il sistema PCR non è corretto o il sistema è troppo piccolo.
Suggerimento: se il sistema di reazione PCR è troppo piccolo, la precisione del rilevamento diminuirà.È preferibile utilizzare il sistema di reazione consigliato dallo strumento PCR quantitativo per eseguire nuovamente l'esperimento PCR in tempo reale.