La PCR è la tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici più utilizzata ed è ampiamente utilizzata per la sua sensibilità e specificità.Tuttavia, la PCR richiede ripetute denaturazioni termiche e non può eliminare i limiti dell'affidamento a strumenti e apparecchiature, il che ne limita l'applicazione nei test clinici sul campo.

Dall'inizio degli anni '90, molti laboratori hanno iniziato a sviluppare una tecnologia di amplificazione a temperatura costante che non richiede la denaturazione termica.Ora hanno sviluppato la tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop, la tecnologia di amplificazione isotermica di sostituzione del filamento, la tecnologia di amplificazione isotermica del cerchio rotante e la dipendenza dalla sequenza dell'acido nucleico.Tecnologia di amplificazione isotermica e altre tecnologie. 

Lamplificazione isotermica mediata da oop

Il principio di amplificazione si basa sul fatto che il DNA si trova in uno stato di equilibrio dinamico a circa 65°C.Quando un primer è appaiato di basi ed esteso alla parte complementare del DNA a doppio filamento, l'altro filamento si dissocerà e diventerà a singolo filamento.

A questa temperatura, il DNA utilizza 4 primer specifici per fare affidamento su una DNA polimerasi di spostamento del filamento per far circolare continuamente la sintesi del DNA di spostamento del filamento.

Innanzitutto determinare le 6 regioni specifiche F3, F2, F1, B1, B2, B3 sul gene bersaglio, quindi progettare 4 primer basati su queste 6 regioni specifiche (come mostrato nella figura seguente):

Il forward inner primer (FIP) è composto da F1c e F2.

Il reverse inner primer (BIP) è composto da B1c e B2 e TTTT è usato come distanziatore nel mezzo.

I primer esterni F3 e B3 sono rispettivamente composti da regioni F3 e B3 sul gene bersaglio.

Nel sistema di reazione LAMP, la concentrazione del primer interno è diverse volte quella del primer esterno.Il primer interno viene prima combinato con il filamento modello per sintetizzare un filamento complementare per formare un doppio filamento di DNA.Successivamente, il primer esterno viene combinato con il filamento modello per formare un doppio filamento di DNA.Sotto l'azione della BstDNA polimerasi, viene rilasciato il filamento complementare sintetizzato dal primer interno.Dopo una serie di reazioni, il filamento complementare forma infine un singolo filamento di DNA con una struttura a manubrio.

Lo stesso filamento singolo di DNA con struttura a manubrio viene utilizzato come modello per formare continuamente un DNA con struttura ad anello di transizione con un'estremità aperta.I primer interno ed esterno guidano il DNA della struttura di transizione dello stelo ad anello a subire continuamente reazioni di spostamento e di estensione del filamento e infine formare più strutture ad anello dello stelo con lunghezze diverse.Miscela di DNA.

Vantaggi e svantaggi dell'amplificazione isotermica mediata da loop

Vantaggi della LAMPADA:

(1) Elevata efficienza di amplificazione, che può amplificare efficacemente 1-10 copie del gene bersaglio entro 1 ora e l'efficienza di amplificazione è 10-100 volte quella della normale PCR.

(2) Il tempo di reazione è breve, la specificità è forte e non è richiesta alcuna attrezzatura speciale.

Difetti di LAMP:

(1) I requisiti per i primer sono particolarmente elevati.

(2) Il prodotto amplificato non può essere utilizzato per la clonazione e il sequenziamento, ma può essere utilizzato solo per il giudizio.

(3) A causa della sua forte sensibilità, è facile formare aerosol, causando falsi positivi e influenzando i risultati del test.

Samplificazione di spostamento trand

L'amplificazione dello spostamento del filamento (SDA) è una tecnica di amplificazione del DNA isotermica in vitro basata sulla reazione enzimatica proposta per la prima volta dallo studioso americano Walker nel 1992.

Il sistema di base di SDA include un'endonucleasi di restrizione, una DNA polimerasi con attività di spostamento del filamento, due coppie di primer, dNTP, ioni di calcio e magnesio e sistemi tampone.

Il principio dell'amplificazione dello spostamento del filamento si basa sulla sequenza di riconoscimento dell'endonucleasi di restrizione modificata chimicamente a entrambe le estremità del DNA bersaglio.L'endonucleasi apre il gap nel filamento di DNA nel suo sito di riconoscimento e la DNA polimerasi estende il gap 3' End e sostituisce il successivo filamento di DNA.

I singoli filamenti di DNA sostituiti possono essere combinati con primer ed estesi in doppi filamenti dalla DNA polimerasi.Questo processo viene ripetuto continuamente, in modo che la sequenza target venga amplificata in modo efficiente.

Vantaggi e svantaggi della tecnologia di amplificazione dello spostamento del filamento

Vantaggi di SDA:

L'efficienza di amplificazione è elevata, il tempo di reazione è breve, la specificità è forte e non è richiesta alcuna attrezzatura speciale.

Difetti di SDA:

I prodotti non sono uniformi e alcuni prodotti a filamento singolo e doppio sono sempre prodotti nel ciclo SDA e si verificherà inevitabilmente uno scodamento quando rilevato dall'elettroforesi.

Ramplificazione del cerchio mobile

L'amplificazione del cerchio rotante (RCA) viene proposta attingendo al metodo di copia del DNA da organismi patogeni mediante cerchio rotante.Si riferisce all'uso di DNA circolare a filamento singolo come modello a temperatura costante e una speciale DNA polimerasi (come Phi29) ) Sotto l'azione della sintesi del DNA del cerchio rotante per ottenere l'amplificazione del gene bersaglio.

L'RCA può essere suddiviso in amplificazione lineare e amplificazione esponenziale.L'efficienza dell'RCA lineare può raggiungere 10⁵volte e l'efficienza dell'RCA esponenziale può raggiungere 10⁹volte.

Semplice distinzione, come mostrato nella figura sottostante, l'amplificazione lineare a utilizza solo 1 primer, l'amplificazione esponenziale b ha 2 primer.

L'RCA lineare è anche chiamato RCA a primer singolo.Un primer si lega al DNA circolare e viene esteso dall'azione della DNA polimerasi.Il prodotto è un singolo filamento lineare con un gran numero di sequenze ripetitive migliaia di volte la lunghezza di un singolo loop.

Poiché il prodotto dell'RCA lineare è sempre collegato all'innesco di partenza, la facile fissazione del segnale è un grande vantaggio.

RCA esponenziale, noto anche come amplificazione iperramificata HRCA (RCA iperramificato), in RCA esponenziale, un primer amplifica il prodotto RCA, il secondo primer si ibrida con il prodotto RCA e si estende e la sostituzione è già legata al prodotto RCA I primer a valle estendono il filamento e ripetono l'estensione e la sostituzione per produrre un prodotto di amplificazione RCA dendritico.

I vantaggi e gli svantaggi dell'amplificazione dell'acido nucleico del cerchio rotante

Vantaggi dell'RCA:

Alta sensibilità, buona specificità e facilità d'uso.

Difetti di RCA:

Problemi di fondo durante il rilevamento del segnale.Durante la reazione RCA, la sonda del lucchetto non circolata e il DNA o l'RNA stampo della sonda non legata possono generare alcuni segnali di fondo. 

Namplificazione basata sulla sequenza dell'acido ucleico

L'amplificazione basata sulla sequenza dell'acido nucleico (NASBA) è una nuova tecnologia sviluppata sulla base della PCR.È un'amplificazione continua e isotermica dell'acido nucleico guidata da una coppia di primer con una sequenza promotrice T7.La tecnologia può amplificare l'RNA modello di circa 109 volte in circa 2 ore, che è 1000 volte superiore rispetto al metodo PCR convenzionale e non richiede attrezzature speciali.

Questa tecnologia è stata utilizzata per la diagnosi rapida delle malattie non appena è apparsa e molte aziende attualmente utilizzano questo metodo nei kit di rilevamento dell'RNA.

Sebbene l'amplificazione dell'RNA possa anche utilizzare la tecnologia PCR a trascrizione inversa, NASBA ha i suoi vantaggi: può essere eseguita in condizioni di temperatura relativamente costanti ed è più stabile e accurata della tecnologia PCR tradizionale.

La reazione è a 41 gradi Celsius e richiede trascrittasi inversa AMV (avian myeloblastosis virus), RNase H, T7 RNA polimerasi e un paio di primer per essere completata.

Il processo prevede principalmente:

Il forward primer contiene la sequenza complementare del promotore T7.Durante la reazione, il forward primer si lega al filamento di RNA e viene catalizzato dall'enzima AMV per formare un doppio filamento di DNA-RNA.

RNase H digerisce l'RNA nel doppio filamento ibrido e conserva il DNA a singolo filamento.

Sotto l'azione del primer inverso e dell'enzima AMV, si forma un doppio filamento di DNA contenente la sequenza del promotore T7.

Sotto l'azione della T7 RNA polimerasi, il processo di trascrizione è completato e viene prodotta una grande quantità di RNA bersaglio.

Vantaggi della NASBA:

(1) Il suo primer ha una sequenza di promotore T7, ma il DNA estraneo a doppio filamento non ha sequenza di promotore T7 e non può essere amplificato, quindi questa tecnologia ha un'elevata specificità e sensibilità.

(2) NASBA incorpora direttamente il processo di trascrizione inversa nella reazione di amplificazione, accorciando il tempo di reazione.

Svantaggi della NASBA:

(1) I componenti della reazione sono più complicati.

(2) Sono necessari tre tipi di enzimi per aumentare il costo della reazione.