Come nuovo in laboratorio, non è un buon lavoro escludere le piante positive da un gruppo di piante con un basso tasso di conversione.In primo luogo, il DNA deve essere estratto da un gran numero di campioni uno per uno, quindi i geni estranei verranno rilevati mediante PCR.Tuttavia, i risultati sono spesso spazi vuoti e bande con alcuni elementi occasionalmente, ma è impossibile determinare se ci sono rilevamenti mancati o falsi rilevamenti..È molto impotente affrontare tale processo e risultati sperimentali?Non preoccuparti, il fratello ti insegna come eliminare le piante positive transgeniche in modo semplice e accurato.

Passo 1

Primer di rilevamento del design

Determinare il gene endogeno e il gene esogeno da rilevare in base al campione da testare e selezionare una sequenza rappresentativa di 100-500 bp nel gene per la progettazione del primer.Buoni primer possono garantire l'accuratezza dei risultati di rilevamento e abbreviare il tempo di rilevamento (vedere l'appendice per i primer di rilevamento comunemente utilizzati).

Avviso: i primer di nuova concezione devono ottimizzare le condizioni di reazione e verificare l'accuratezza, la precisione e il limite di rilevamento del rilevamento prima del rilevamento su larga scala.

Passo 2

Progettare il protocollo sperimentale

Controllo positivo: utilizzare il DNA purificato contenente il frammento bersaglio come modello per determinare se il sistema di reazione PCR e le condizioni sono normali.

Controllo negativo/bianco: utilizzare il modello di DNA o ddH2O che non contiene il frammento target come modello per rilevare se esiste una fonte di contaminazione nel sistema PCR.

Controllo di riferimento interno: utilizzare la combinazione primer/sonda del gene endogeno del campione da testare per valutare se il templato può essere rilevato mediante PCR.

Avviso:

I controlli positivi, negativi/bianchi e i controlli di controllo interno devono essere impostati per ciascun test per valutare la validità dei risultati sperimentali.

Preparazione dell'esperimento

Prima dell'uso, osservare se la soluzione è uniformemente miscelata.Se viene rilevata la precipitazione, deve essere sciolta e miscelata secondo le istruzioni prima dell'uso.La miscela 2×PCR deve essere pipettata e miscelata ripetutamente con una micropipetta prima dell'uso per evitare una distribuzione irregolare degli ioni.

Avviso:

Estrarre il manuale e leggerlo attentamente e fare i preparativi prima dell'esperimento in stretta conformità con i requisiti del manuale.

Passaggio 4

Preparare il sistema di reazione PCR

Secondo il protocollo sperimentale, miscelare uniformemente i primer, H2O e 2×PCR mix, centrifugare e distribuirli in ciascuna provetta di reazione.

Avviso:

Per test su larga scala oa lungo termine, si consiglia di utilizzare un sistema di reazione PCR contenente l'enzima UNG, che può evitare efficacemente la contaminazione da aerosol causata dai prodotti PCR.

Passaggio 5

Aggiungi modello di reazione

Utilizzando la tecnologia Direct PCR, non è necessario il noioso processo di purificazione dell'acido nucleico, il modello del campione può essere preparato entro 10 minuti e può essere aggiunto il corrispondente sistema di reazione PCR.

Avviso:

Il metodo di scissione ha un migliore effetto di rilevamento e il prodotto ottenuto può essere utilizzato per più reazioni di rilevamento.

5.1: Espansione diretta delle foglie

In base alle dimensioni dell'immagine nel manuale, tagliare il tessuto fogliare con un diametro di 2-3 mm e posizionarlo nel sistema di reazione PCR.

Nota: assicurarsi che i frammenti fogliari siano completamente immersi nella soluzione di reazione PCR e non aggiungere tessuto fogliare eccessivo.

5.2: Metodo della divisione delle foglie

Tagliare il tessuto fogliare con un diametro di 5-7 mm e metterlo in una provetta da centrifuga.Se scegli foglie mature, evita di utilizzare i tessuti della nervatura principale della foglia.Pipettare 50 ul di tampone P1 lisato in una provetta da centrifuga per assicurarsi che il lisato possa immergere completamente il tessuto fogliare, collocarlo in un termociclatore o in un bagno di metallo e lisare a 95°C per 5-10 minuti.

Aggiungere 50ul di soluzione di neutralizzazione Buffer P2 e mescolare bene.Il lisato risultante può essere utilizzato come modello e aggiunto al sistema di reazione PCR.

Nota: la quantità di templato è compresa tra il 5 e il 10% del sistema PCR e non deve superare il 20% (ad esempio, in un sistema PCR da 20 μl, aggiungere 1-2 μl di soluzione di lisi, non più di 4 μl).

Passaggio 6

Reazione PCR

Dopo aver centrifugato la provetta di reazione per PCR, questa viene posta in uno strumento per PCR per l'amplificazione.

Avviso:

La reazione utilizza un modello non purificato per l'amplificazione, quindi il numero di cicli di amplificazione è di 5-10 cicli in più rispetto a quando si utilizza un modello di DNA purificato.

Passaggio 7

Rilevamento dell'elettroforesi e analisi dei risultati

M: Scala del DNA da 100 bp

1\4: Metodo del DNA purificato

2\5: metodo PCR diretto

3\6: Controllo vuoto

Controllo di qualità:

I risultati del test dei vari controlli impostati nell'esperimento devono soddisfare le seguenti condizioni.In caso contrario, la causa del problema dovrebbe essere analizzata e il test dovrebbe essere eseguito nuovamente dopo che il problema è stato eliminato.

Tabella 1. Risultati dei test normali di vari gruppi di controllo

*Quando il plasmide viene utilizzato come controllo positivo, il risultato del test del gene endogeno può essere negativo

Giudizio del risultato:

R. Il risultato del test del gene endogeno del campione è negativo, indicando che il DNA adatto per il normale rilevamento PCR non può essere estratto dal campione o che il DNA estratto contiene inibitori della reazione PCR e che il DNA deve essere estratto nuovamente.

B. Il risultato del test del gene endogeno del campione è positivo e il risultato del test del gene esogeno è negativo, indicando che il DNA adatto per il normale rilevamento della PCR viene estratto dal campione e si può ritenere che il gene XXX non viene rilevato nel campione.

C. Il risultato del test del gene endogeno del campione è positivo e il risultato del test del gene esogeno è positivo, indicando che dal campione è stato estratto DNA adatto per il normale rilevamento della PCR e che il DNA del campione contiene il gene XXX.Gli esperimenti di conferma possono essere ulteriormente eseguiti.

Passaggio 8

Primer di rilevamento del design

Dopo l'esperimento, utilizzare una soluzione di ipoclorito di sodio al 2% e una soluzione di etanolo al 70% per pulire l'area sperimentale per prevenire l'inquinamento ambientale.