Di recente, ho scoperto qualcosa di incredibile!Molti professionisti di esperimenti avanzati intorno a lui non conoscono nemmeno alcuni punti di conoscenza sperimentale molto basilari.

Ad esempio, puoi rispondere alle seguenti domande?

C'è differenza tra OD260 e A260?Cosa significa ciascuno?
OD è l'abbreviazione di densità ottica (densità ottica), A è l'abbreviazione di assorbanza (assorbanza), i due concetti sono in realtà gli stessi, "densità ottica" è "assorbanza", ma "densità ottica" è in linea con la maggior parte degli standard nazionali e più standardizzati.

Di solito misuriamo il valore OD a 260 nm per calcolare la concentrazione di acido nucleico, quindi cosa rappresenta 1OD?
L'acido nucleico ha un picco massimo di assorbimento a una lunghezza d'onda di 260 nm, che contiene sia DNA che RNA, nonché frammenti di acido nucleico frammentati (questo è il punto chiave).
Il valore OD misurato a una lunghezza d'onda di 260 nm è stato registrato come OD260.Se il campione è puro, il valore OD260 può calcolare la concentrazione del campione di acido nucleico.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (DNA a doppio filamento)
=37 μg/ml ssDNA (DNA a filamento singolo)
= 40 μg/ml di RNA
=30 μg/ml dNTP (oligonucleotidi)
C'è qualche connessione e differenza tra RT-PCR, Realtime-PCR e QPCR?
RT-PCR è l'abbreviazione di Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, abbreviazione di Quantitative Real Time PCR
Sebbene la PCR in tempo reale (PCR quantitativa fluorescente in tempo reale) e la PCR a trascrizione inversa (PCR a trascrizione inversa) sembrino entrambe abbreviate in RT-PCR.Ma la convenzione internazionale è: RT-PCR si riferisce specificamente alla PCR a trascrizione inversa.

Quali sono nt, bp e kb comunemente usati per descrivere la lunghezza del DNA/RNA in biologia?
nt = nucleotide
bp = coppia di basi coppia di basi
kb = kilobase

Certo, diresti che molte persone non si preoccupano di questi piccoli dettagli!Tutti lo fanno e nessuno ti chiederà cosa sia.Sai che non è necessario, vero?

No, no, no, è molto necessario saperlo!a causa di quale?
Perché vuoi pubblicare un articolo!Fratello!Che tu stia mirando alla laurea o perseguendo risultati di ricerca scientifica, devi fare affidamento sugli articoli per parlare!

L'estrazione dell'acido nucleico dovrebbe essere l'esperimento più semplice e basilare.La qualità dell'estrazione dell'acido nucleico determina direttamente i risultati degli esperimenti successivi.

Anche se l'ho detto molte volte, ci sono ancora molti amici a cui non importa.Questa volta ho deciso di uscire dall'articolo!

Informazioni minime per la pubblicazione di esperimenti di PCR quantitativa in tempo reale, denominate MIQE, è una serie di linee guida per esperimenti quantitativi di fluorescenza lanciata a livello internazionale, che propone standard minimi per le informazioni sperimentali necessarie per valutare esperimenti PCR quantitativi di fluorescenza e pubblicare articoli.Attraverso le condizioni sperimentali ei metodi di analisi forniti dallo sperimentatore, i revisori possono valutare meglio la validità dello schema sperimentale del ricercatore.

Si può vedere che nella sezione dell'estrazione dell'acido nucleico sono stati proposti i seguenti elementi di rilevamento,

“E” indica le informazioni che devono essere fornite e “D” indica le informazioni che dovrebbero essere fornite se necessario.

La forma è molto complicata, infatti, voglio dire che tutti devono partire da

purezza (D), resa (D), integrità (E) e consistenza (E) per valutare gli acidi nucleici in questi quattro aspetti.

Secondo le abitudini sperimentali, prima parla dei metodi di valutazione della purezza e della concentrazione.

La misurazione OD è il metodo di rilevamento preferito e più semplice per gli sperimentatori.Per quanto riguarda il principio, non entrerò nei dettagli qui.Molti laboratori ora utilizzano spettrofotometri ultra-micro per analizzare quantitativamente direttamente campioni di acido nucleico.Durante la visualizzazione del valore di assorbanza, il programma fornisce direttamente il valore di concentrazione (acido nucleico, proteine ​​e colorante fluorescente) ei relativi rapporti.Per quanto riguarda l'analisi del valore OD, salva questa immagine e andrà tutto bene.

Elenco di soluzioni per valori OD universali

Tuttavia, ci sono alcuni avvertimenti che devono essere evidenziati separatamente per te.

(Dopotutto, so che devi essere tu a risparmiare e ad aspettare finché non ne avrai bisogno!)

Nota 1 Attrezzatura

Il valore OD sarà influenzato da apparecchiature diverse.Finché OD260 rientra in un certo intervallo, i valori di OD230 e OD280 sono significativi.Ad esempio, l'intervallo di assorbanza del comune Eppendorf D30 a 260 nm è 0~3A e il NanoDrop One di Thermo è a 260 nm.L'intervallo di assorbanza di 0,5 ~ 62,5 A.

Nota 2Reagente di diluizione

Il valore OD può essere influenzato dalla diluizione di diversi reagenti.Ad esempio, la lettura OD260/280 dell'RNA purificato in pH7,5 10 mm Trisbuffer è compreso tra 1,9 e 2,1, mentre insoluzione acquosa neutrail rapporto sarà più basso, forse solo 1,8-2,0, ma questo non significa che la qualità dell'RNA cambia Differenza.

Nota 3Sostanze residue

L'esistenza di sostanze residue influirà sull'accuratezza della misurazione della concentrazione di acido nucleico, pertanto è necessario evitare quanto più possibile residui di proteine, fenoli, polisaccaridi e polifenoli nei campioni di acidi nucleici.

Tuttavia, in realtà, l'estrazione con reagenti organici è un vecchio metodo.Nei kit commerciali, l'effetto di estrazione può essere ottenuto attraverso una colonna di adsorbimento a base di silice combinata con la centrifugazione, evitando reagenti organici tossici e dannosi che sono difficili da rimuovere, ecc. Il problema, comeIl kit di estrazione dell'acido nucleico di Foregene, non utilizza DNasi/RNasi e reagenti organici tossici durante l'operazione, veloce e sicuro, e ileffetto èBene(ha detto per caso che era calvo, ma so che vuoi saperlo).

Esempio 1: resa e purezza dell'estrazione del DNA genomico

Il kit di isolamento del DNA del suolo Foregene (DE-05511) tratta campioni di suolo provenienti da varie fonti e la quantità e la purezza del DNA genomico ottenuto sono mostrate nella tabella seguente:
Esempio 2: resa e purezza dell'estrazione dell'RNA tissutale

Il kit di isolamento dell'RNA totale animale (RE-03012) ha elaborato vari campioni di tessuto e la quantità e la purezza dell'RNA ottenuto sono mostrate nella tabella seguente (per tessuto di topo):
Tuttavia, non pensare di aver finito con il valore OD.Ti sei preso cura dei punti chiave che ho disegnato per te nella parte anteriore?

Avviso

Nell'assorbanza saranno calcolate anche le molecole di acido nucleico frammentate.Supponendo che tu abbia residui di DNA genomico nell'RNA, il tuo valore OD sembrerà molto alto, ma la concentrazione effettiva di RNA non può essere determinata.Se il tuo RNA è Non è chiaro se c'è degradazione, quindi abbiamo ancora bisogno di un metodo di valutazione completo per dare un giudizio più accurato, cioè la valutazione dell'integrità dell'acido nucleico menzionata nel MIQE.