Le tradizionali trascrittasi inverse non possono tollerare temperature elevate (la temperatura ottimale per l'attività MMLV è di 37-50°C e l'AMV è di 42-60°C).L'RNA virale più complesso non può essere efficacemente retrotrascritto in cDNA a basse temperature, con conseguente riduzione dell'efficienza di rilevamento.La RT-qPCR tradizionale richiede generalmente la partecipazione di due enzimi chiave (trascrittasi inversa e DNA polimerasi), il che rende impossibile semplificare il funzionamento del sistema di reazione e ridurre i costi.Qui introdurremo due trascrittasi inverse resistenti alle alte temperature, TtH e RevTaq.Questi due enzimi hanno anche la funzione di DNA polimerasi, quindi sono chiamati enzimi bifunzionali.

TtH DNA polimerasi

Devi aver sentito parlare del TtH, che deriva dal batterio termofilo Thermus thermophilus HB8.In presenza di cationi bivalenti come Mg2+, ha attività di DNA polimerasi.È ampiamente utilizzato nelle reazioni PCR come l'enzima Taq, ma ha una maggiore resistenza al calore rispetto all'enzima Taq, quindi ha anche un effetto migliore sulla PCR con modelli ad alto contenuto di GC.

· Questo enzima fondamentalmente non ha attività esonucleasica 3′→5′ e attività esonucleasica 5′→3′, quindi può essere utilizzato anche per il sequenziamento dideossi.

· Questo enzima ha attività RTase.In presenza di Mn2+, l'attività RTasi sarà potenziata.Utilizzando questa funzione, può essere utilizzato per eseguire la reazione di trascrizione inversa e la reazione PCR nella stessa provetta, ovvero RT-PCR in una fase.Tuttavia, in presenza di Mn2+, l'accuratezza della RT-PCR non è elevata.L'attività RT non ha nulla a che fare con l'attività dell'rnaasi H.

· L'aumentata attività della Tth-DNA polimerasi (pH9, ottimale +55℃～+70℃, massimo +95℃) supera i problemi causati dalla struttura secondaria dell'RNA.Il cDNA risultante può essere amplificato mediante PCR con lo stesso enzima in presenza di ioni Mg2+.

· La capacità della Tth-DNA polimerasi di eseguire la trascrizione inversa e l'amplificazione del DNA ad alte temperature rende questo enzima utile per l'RT-PCR quantitativa, il clonaggio e l'analisi dell'espressione genica dell'RNA cellulare e virale.
· La Tth-DNA polimerasi viene utilizzata per RT-PCR per amplificare l'RNA fino a 1 kb.

Caratteristiche e vantaggi

Tth DNA polimerasi:

• Garantire la dimensione ottimizzata del prodotto della reazione a catena della polimerasi (PCR), almeno 1000 bp nella reazione RT-PCR

• Accettare il desossiribonucleoside trifosfato modificato come substrato

• Non correlato all'attività dell'RNasi H

• Ha un'elevata stabilità termica per superare i problemi, solitamente legati all'elevata struttura secondaria presente nell'RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimerasi

Una DNA polimerasi resistente al calore con attività di trascrittasi inversa

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerasi è un enzima ingegnerizzato, altamente resistente al calore, a doppia funzionalità con attività di trascrittasi inversa e DNA polimerasi ottenute attraverso l'evoluzione diretta e artificiale.

· L'emivita della DNA polimerasi RevTaq RT-PCR a 95°C è superiore a 40 minuti.

· La DNA polimerasi RevTaq RT-PCR consente la trascrizione inversa ad alta temperatura direttamente dal modello di RNA e la fase di trascrizione inversa può essere ripetuta più volte per generare più modelli di cDNA.

· La DNA polimerasi RevTaq RT-PCR consente la RT-PCR “zero-step” (nessuna fase di trascrizione inversa isotermica), poiché nella fase di estensione della PCR ciclica, la trascrizione inversa e l'amplificazione del DNA avvengono simultaneamente.Ciò promuove anche la reazione di trascrizione inversa ad alte temperature, riducendo così al minimo i problemi incontrati nella fusione della forte struttura secondaria nell'RNA ad alte temperature.

· Grazie alla formula hot-start a base di aptamero, la DNA polimerasi RevTaq RT-PCR produrrà risultati migliori quando la temperatura di ricottura e di estensione è superiore a 57°C.

· Poiché l'enzima è resistente al calore, si consiglia di progettare primer e sonde con punti di fusione molto elevati (>60°C).

· Si consiglia di ottimizzare la temperatura della fase di ricottura/estensione attraverso un gradiente di temperatura durante il processo di impostazione della reazione.

· Maggiore è la temperatura, maggiore è la specificità della PCR.Il ciclo di trascrizione inversa viene solitamente eseguito a una temperatura più elevata rispetto al ciclo PCR, poiché l'ibridazione DNA Primer:RNA Template di solito ha un punto di fusione più elevato rispetto al DNA Primer:cDNA Template duplex.

· La DNA polimerasi RevTaq RT-PCR è geneticamente modificata e ottimizzata e la dimensione dell'amplicone è compresa tra 60 e 300 bp.

Il limite di rilevazione della DNA polimerasi RevTaq RT-PCR raggiunge 4 copie/

Il sistema di reazione ottimizzato (l'istituzione di primer ad alto punto di fusione) è mostrato nella figura.RevTaq RT-PCR La RT-PCR guidata dalla DNA polimerasi mostra una sensibilità migliore rispetto alla master mix TaqPath 1-step RT-qPCR e un gradiente di diluizione del campione di rilevamento inferiore.

Ulteriori vantaggi:

Funzione di avvio rapido → La fase iniziale di denaturazione termica può essere saltata.

Formula aptamerica hot-start → Fornisce immediatamente il 100% di attività enzimatica e previene l'amplificazione non specifica a basse temperature (<57°C).

Funzione di clivaggio → La fase di estrazione dell'RNA è omessa, perché RevTaq RT-PCR DNA polimerasi può anche processare campioni di reazione grezzi.Può distruggere immediatamente le membrane cellulari di eucarioti, batteri e virus in un ciclo RT-PCR a caldo.

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