Domande frequenti perKit di isolamento dell'RNA totale animale

La seguente analisi dei problemi che potresti incontrare inestrazione di RNA da tessuti/cellule animali will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

L'RNA non viene estratto o le rese di RNA sono basse

Ci sono spesso una varietà di fattori che influenzano l'efficienza del recupero, come: contenuto di RNA del campione di tessuto, metodo di funzionamento, volume di eluizione, ecc.

1. Durante il funzionamento è stato eseguito un bagno di ghiaccio o una centrifugazione criogenica (4 °C).

Raccomandazione: Operare a temperatura ambiente (15-25°C) durante tutto il processo, non ghiacciare il bagno e centrifugare a basse temperature.

2. Conservazione impropria del campione o tempo di conservazione del campione eccessivo.

Raccomandazione: conservare i campioni a -80 °C o congelarli in azoto liquido ed evitare l'uso ripetuto di congelamento-scongelamento;provare a utilizzare tessuto fresco o cellule in coltura per l'estrazione dell'RNA.

3. Lisi del campione insufficiente.

Raccomandazione: durante l'omogeneizzazione del tessuto, assicurarsi che il tessuto sia sufficientemente omogeneizzato e che le cellule del tessuto siano sufficientemente divise per spiegare il rilascio di RNA.

4. L'eluente non è stato aggiunto correttamente.

Raccomandazione: confermare che RNase-Free ddH₂O viene aggiunto goccia a goccia al centro della membrana della colonna di purificazione.

5. Non è stato aggiunto il volume corretto di etanolo assoluto al tampone RL2 o al tampone RW2.

Raccomandazione: seguire le istruzioni, aggiungere il volume corretto di etanolo assoluto al tampone RL2 e al tampone RW2 e miscelare bene prima di utilizzare il kit.

6. Il dosaggio del campione di tessuto non è appropriato.

Raccomandazione: utilizzare 10-20 mg di tessuto o (1-5) × 10⁶cellule per 500 microlitri di tampone RL1, poiché l'uso eccessivo di tessuto può comportare una ridotta estrazione di RNA.

7. Volume di eluizione improprio o eluizione incompleta.

Raccomandazione: il volume di eluizione della colonna di purificazione è di 50-200 μl;se l'effetto di eluizione non è soddisfacente, si consiglia di prolungare il tempo di posizionamento a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di ddH senza RNasi preriscaldato₂O, ad esempio per 5-10 min.

8. La colonna di purificazione presenta residui di etanolo dopo il lavaggio del tampone RW2.

Raccomandazione: se è presente un residuo di etanolo dopo il lavaggio del tampone RW2, la centrifugazione a tubo vuoto per 1 minuto, il tempo per l'operazione di centrifugazione a tubo vuoto può essere aumentato a 2 minuti oppure la colonna di purificazione può essere posizionata a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere adeguatamente l'etanolo residuo.

L'RNA purificato viene degradato

La qualità dell'RNA purificato è correlata a fattori quali la conservazione del campione, la contaminazione da RNasi e la manipolazione, ecc.

1. I campioni di tessuto non vengono conservati in tempo.

Raccomandazione: se i campioni di tessuto o le cellule non vengono utilizzati tempestivamente dopo la raccolta, criopreservare immediatamente a -80 °C o azoto liquido.Per estrarre l'RNA, utilizzare un campione di tessuto o di cellule appena prelevato quando possibile.

2. Congelamento-scongelamento ripetuto di campioni di tessuto.

Raccomandazione: quando si conservano i campioni di tessuto, è meglio tagliarli in piccoli pezzi per la conservazione e rimuovere uno dei pezzi quando li si utilizza per evitare il ripetuto congelamento-scongelamento del campione e la degradazione dell'RNA.

3. L'RNasi viene introdotta o non si indossano guanti monouso, maschere, ecc. durante l'operazione.

Raccomandazione: gli esperimenti di estrazione dell'RNA vengono eseguiti al meglio in stanze di manipolazione dell'RNA separate e il tavolo viene cancellato prima dell'esperimento.

Indossare guanti e maschere monouso durante l'esperimento per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA causata dall'introduzione di RNase.

4. I reagenti sono contaminati da RNasi durante l'uso.

Raccomandazione: sostituire con un nuovo kit di isolamento dell'RNA totale animale per esperimenti correlati.

5. Le provette da centrifuga, i puntali, ecc. utilizzati nella manipolazione dell'RNA sono contaminati da RNasi.

Raccomandazione: confermare che le provette da centrifuga, i puntali, le pipette, ecc. utilizzati nell'estrazione dell'RNA siano tutti privi di RNasi.

L'RNA ottenuto purificato influisce sugli esperimenti a valle

L'RNA purificato dalla colonna di purificazione, se gli ioni di sale, il contenuto proteico è troppo grande influenzerà l'esperimento a valle, come ad esempio: trascrizione inversa, Northern Blot et al.

1. L'RNA eluito ha residui di ioni salini.

Raccomandazione: verificare che sia stato aggiunto il volume corretto di etanolo al tampone RW2 ed eseguire 2 lavaggi della colonna di purificazione alla velocità centrifuga indicata per il funzionamento;se sono presenti residui di ioni salini, lasciare la colonna di purificazione nel tampone RW2 per 5 minuti a temperatura ambiente ed eseguire la centrifugazione per massimizzare la rimozione della contaminazione salina.

2. Residuo di etanolo nell'RNA eluito.

Raccomandazione: Confermare che dopo il lavaggio del tampone RW2, eseguire l'operazione di centrifugazione del tubo vuoto alla velocità di centrifugazione indicata per il funzionamento, aumentare il tempo dell'operazione di centrifugazione del tubo vuoto a 2 min se sono ancora presenti residui di etanolo o lasciarlo a temperatura ambiente per 5 min dopo la centrifugazione del tubo vuoto per massimizzare la rimozione del residuo di etanolo.

Isolamento di campioni di acido nulceico

I kit di isolamento dell'RNA di Foregene possono ottenere l'isolamento/estrazione totale dell'RNA dalle seguenti fonti di campioni: tessuto animale, pianta, cellule, virus, sangue, ecc.

Come conservo il kit

Conservazione a temperatura ambiente per 24 mesi.