RT-qPCR è l'esperimento di base della biologia molecolare e tutti devono conoscerlo.Comprende principalmente tre passaggi: estrazione dell'RNA, trascrizione inversa in cDNA e PCR quantitativa fluorescente in tempo reale.Non aiuta, cosa sta succedendo?È probabile che ci sia un problema conl'esperimento di trascrizione inversa!Sebbene sembri che l'esperimento di trascrizione inversa debba solo aggiungere RNA, dNTP, primer etrascrittasi inversaalla provetta da centrifuga e mescolare bene, ma nel processo operativo effettivo ci sono ancora molti dettagli a cui prestare attenzione.Impariamo a conoscerlo!

Come giudicare la qualità dell'RNA?
Per ottenere il cDNA, la qualità dell'RNA è fondamentale!La qualità dell'RNA può essere rilevata principalmente da due aspetti:
(1) Integrità dell'RNA:L'integrità dell'RNA può essere verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Prendendo gli eucarioti come esempio, l'RNA totale completo ha tre bande chiare, i pesi molecolari da grandi a piccoli sono 28S, 18S e 5S, e 28S è due volte più luminoso di 18S;se sono visibili tre bande, ma il tipo di banda è sfocato o Diffusione significa che l'RNA è parzialmente degradato.A questo punto, eseguire immediatamente la reazione di trascrizione inversa e aumentare l'input del modello in modo appropriato;se si vede solo una banda con un piccolo peso molecolare o nessuna banda, l'RNA è stato completamente degradato e deve essere riestratto.Agilent 2100 indica l'integrità dell'RNA con il diagramma dei picchi e il valore RIN.Se l'acido nucleico è intatto, la linea di base dell'elettroferogramma è piatta;se l'acido nucleico è gravemente degradato, la linea di base è irregolare e compaiono più picchi di degradazione;il valore di RIN riflette l'integrità dell'RNA, nell'intervallo 0-10, maggiore è il valore, migliore è la qualità dell'RNA.Bene, maggiore è il grado di completezza.
(2) Purezza dell'RNA:Il rapporto di OD260/280 può essere rilevato mediante spettrofotometria UV.Se il rapporto di OD260/280 è compreso tra 1,9 e 2,1, la purezza è molto buona.
Il DNA genomico residuo può portare a risultati quantitativi imprecisi
Quando l'RNA viene estratto, l'RNA che otteniamo può essere mescolato con DNA genomico (gDNA) che non è stato ripulito.Pertanto, anche il cDNA dopo la trascrizione inversa verrà miscelato congDNA.Durante la discesaqPCRreazione,cDNAe gDNA possono essere amplificati simultaneamente, risultando in un valore CT relativamente piccolo, quindi i risultati potrebbero essere distorti.
Quindi cosa dovremmo fare in questa situazione?Foregenesuggerisce:
(1) Eseguire la pulizia del genoma sull'RNA invertito, che può essere rimosso mediante estrazione della colonna durante l'estrazione dell'RNA;
(2) Trattare l'RNA estratto con DNasiI , ma terminarlo con EDTA;
dei reagenti di trascrizione inversacon moduli di pulizia del genoma;

Come scegliere i primer per la trascrizione inversa?
I primer di trascrizione inversa influenzano anche l'esito della reazione di trascrizione inversa.È possibile scegliere primer casuali, Oligo dT o primer gene-specifici per la trascrizione inversa in base alle circostanze specifiche dell'esperimento:
(1) Trascrizioni specifiche: sono raccomandati primer gene-specifici;
(2) Trascrizioni di frammenti lunghi: Si raccomandano primer Oligo dT/gene-specifici;
(3) Frammenti interni di trascrizioni a segmenti lunghi: primer gene-specifici/ primer random / primer random + Oligo dT.Se viene eseguito il successivo esperimento qPCR, Oligo dT non può essere utilizzato da solo, poiché l'utilizzo di Oligo dT da solo può causare una polarizzazione dell'estremità 3 ′, portando a risultati dell'esperimento qPCR imprecisi;
(4) miRNA: È possibile utilizzare primer stem-loop o tailing primer.

Quante volte deve essere diluito il cDNA del prodotto di trascrizione inversa per la quantificazione?
Dopo aver ottenuto il cDNA del prodotto di trascrizione inversa, quante volte il cDNA deve essere diluito per gli esperimenti qPCR è molto importante.Se la concentrazione di cDNA è troppo alta o troppo bassa, l'efficienza dell'amplificazione potrebbe risentirne.È possibile misurare la concentrazione di cDNA e come dovrebbe essere eseguita?
(1) La concentrazione di cDNA del prodotto di trascrizione inversa non può essere misurata, poiché oltre al prodotto di trascrizione inversa, il prodotto di trascrizione inversa contiene anche tampone residuo di trascrizione inversa, trascrittasi inversa, primer, ecc., che interferiranno con i risultati della misurazione della concentrazione e causeranno un rapporto OD260/280, OD260/230 anormale e quindi non riflette la vera resa del cDNA.In questo momento, diranno alcuni amici, allora misurerò la concentrazione dopo la purificazione;qui, Foregene vorrebbe ricordare che non è consigliabile purificare il cDNA, perché la lunghezza del cDNA ottenuta dall'inversione è diversa e il cDNA corto andrà perso nella purificazione.
(2) Quindi cosa fare?Prima dell'esperimento qPCR, il gradiente di diluizione del cDNA può essere determinato attraverso il pre-esperimento.Ad esempio: utilizzare la soluzione stock di cDNA, la diluizione 10 volte e la diluizione 100 volte come modelli per gli esperimenti qPCR e selezionare il fattore di diluizione con un valore CT compreso tra 18 e 28.

Come dovrebbero essere retrotrascritti i miRNA?
miRNA è una piccola molecola di RNA a filamento singolo con una dimensione di circa 22 nt che non codifica per le proteine.A causa della sua breve lunghezza, il metodo qPCR convenzionale è difficile da quantificare direttamente, quindi è spesso necessario estendere il miRNA;i metodi di trascrizione inversa comunemente usati per miRNA includono il metodo stem-loop e il metodo tailing.
Il metodo stem-loop consiste nell'estendere il miRNA aggiungendo primer stem-loop.Questo metodo di rilevamento ha una maggiore sensibilità e specificità, ma il throughput di rilevamento è basso.Una trascrizione inversa può rilevare solo un miRNA e un riferimento interno;il metodo di aggiunta della coda è composto da due È completato dall'azione congiunta di due enzimi, che sono PolyA polimerasi e trascrittasi inversa.La poliA polimerasi è responsabile dell'aggiunta di code PolyA al miRNA per aumentarne la lunghezza e la trascrittasi inversa esegue la reazione di trascrizione inversa.Questo metodo ha un elevato throughput di rilevamento e può rilevare più miRNA e riferimenti interni in una trascrizione inversa, ma la sensibilità e la specificità sono basse nel metodo stem-loop.