Tutti parlano del principio dell'esperimento qRT-PCR, della progettazione dei primer, dell'interpretazione dei risultati, ecc., ma penso che dovrei condividere con voi l'operazione sperimentale di qRT-PCR.È piccolo, ma riguarda i risultati.
Prima di eseguire qRT-PCR, dobbiamo avere una chiara comprensione del nostro RNA e dei nostri metodi operativi.Dopotutto, i nostri sforzi mirano a ottenere risultati, piuttosto che semplicemente a praticare.Quindi, prima di eseguire qRT-PCR, dobbiamo determinare i seguenti problemi (alcuni dei quali sono applicabili solo a SYBR).
1 Sei sicuro che il tuo RNA non sia degradato?
NanoDrop 2000 può solo rilevare la concentrazione e la purezza dell'RNA, ma non può rilevare l'integrità dell'RNA.
Il valore RNA (RNA Intesity Number) può riflettere l'integrità dell'RNA, che viene rilevato dal sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagramma schematico dei valori RIN per diversi campioni di RNA (eucarioti)
Tuttavia, i laboratori generalmente non dispongono di Agilent 2100 Bioanalyzer.In questo caso, possiamo rilevare attraverso il gel di formaldeide, ma il requisito per la quantità totale di RNA è elevato, quindi il metodo più veloce è utilizzare l'elettroforesi su gel ordinaria.È necessario trovarsi in un ambiente privo di nucleasi, quindi è necessario risciacquare il serbatoio dell'elettroforesi, il flacone del sol, la staffa del gel e il pettine con acqua DEPC.L'agarosio è anche privo di nucleasi (purché sia appena aperto) e il tampone di caricamento deve essere appena aperto il più possibile, con l'1,2% di gel.
Si noti che il gel deve essere completamente sciolto, altrimenti causerà bande disomogenee, come mostrato nel campione 9 in figura.Se il voltaggio è troppo alto o funziona troppo a lungo genererà calore e causerà il degrado dell'RNA, quindi il voltaggio e il tempo dovrebbero essere controllati in modo ragionevole.Inoltre, il gel running può anche determinare ulteriormente se vi sono residui di DNA nel campione e osservare se vi è un gran numero di bande trattenute nel pozzetto di erogazione.
Figura.Rilevamento dell'RNA mediante elettroforesi su gel
2 Sei sicuro della concentrazione del tuo cDNA?
L'esperienza dei fratelli maggiori in laboratorio è che il cDNA del sistema da 20 ul ottenuto da ogni inversione viene diluito direttamente 20 volte, mentre le sorelle post-dottorato vengono diluite 10 volte.Di solito dipendo dalla situazione.Poiché la qualità dell'RNA menzionata da ogni persona è diversa, anche il livello di inversione è diverso e la tecnologia di inversione potrebbe non essere stabile.
Quindi ogni volta che ottengo il cDNA invertito, lo diluirò prima circa 3 volte, quindi userò il gene housekeeping per eseguire RT-PCR, il numero di cicli è generalmente di 25 cicli, per identificare la concentrazione specifica e quindi determinare il fattore di diluizione finale.
3 Sei sicuro che i tuoi primer siano facili da usare?
Può superare la curva di fusione di qRT-PCR, ma questo costa ancora denaro.Per i laboratori senza molti soldi, quando ottengono molti primer, possono usare la normale RT-PCR per vedere se si tratta di una singola banda e identificare la specificità dei primer.Se il laboratorio non è a corto di denaro, la specificità di tutti i primer può essere identificata una volta attraverso la curva di fusione.
4 Sei sicuro che le tue condizioni sperimentali siano adatte?
SYBR dovrebbe essere protetto da una luce intensa, quindi prova a spegnere la luce ambientale quando aggiungi il reagente SYBR e devi solo usare una luce fioca per completarlo.
Conservare SYBR a 4°C.Durante l'uso, capovolgere delicatamente su e giù per miscelare bene per evitare la formazione di schiuma e non agitare vigorosamente.
Ad alcune sorelle più giovani piace tracciare segni sulla lavagna PCR per paura di confondere i campioni, il che è sbagliato.Poiché è molto probabile che i tuoi marcatori influenzino la raccolta di segnali fluorescenti, in genere consiglio ai ragazzi di utilizzare quaderni sperimentali per assistere nella memoria, come mostrato di seguito.
Figura.Diagramma di caricamento del campione qRT-PCR
5 Sei sicuro di farlo bene?
Assicurati di indossare guanti, indossare guanti, indossare guanti e dire cose importanti tre volte.
Per ridurre l'esposizione di SYBR alla luce, personalmente mi piace aggiungere prima un modello, come mostrato nella figura seguente.In base all'esperienza, è probabile che l'aggiunta di una piccola quantità di modello causi errori di campionamento.Pertanto, al fine di ridurre al minimo l'errore causato dall'aggiunta di una piccola quantità di templato, di solito raddoppio nuovamente il campione e raddoppio la quantità quando aggiungo il campione per ridurre la quantità di H2O2 aggiunta.
Figura.Diagramma schematico del caricamento qRT-PCR
Quindi configurare il sistema qRT-PCR come segue.
Figura.Diagramma di preparazione del sistema qRT-PCR
NOTA: il processo di configurazione deve essere eseguito su ghiaccio.
Dopo aver aggiunto il campione, incollare la pellicola sigillante trasparente.Cerca di non toccare con le mani la superficie del film sigillante trasparente, basta operare dallo spazio su entrambi i lati del film.Perché le impronte digitali possono anche influenzare la raccolta di segnali fluorescenti.Quindi utilizzare una centrifuga per centrifugare rapidamente per 10 s a bassa velocità per evitare che il campione si appende al muro.
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Tempo di pubblicazione: 28 aprile 2023
