L'esperimento RT-qPCR include l'estrazione dell'RNA e la valutazione della qualità, la trascrizione inversa e qPCR in tre passaggi, ogni passaggio ha molte precauzioni, che presenteremo in dettaglio di seguito.

Ⅰ.Valutazione della qualità dell'RNA

Nell'esperimento RT-qPCR, dopo il completamento dell'estrazione dell'RNA, è necessario valutare la qualità dell'RNA e l'esperimento di follow-up può essere eseguito solo dopo che è stato qualificato.I metodi di valutazione includono lo spettrofotometro, l'elettroforesi su gel Agilent, l'analisi Agilent 2100, tra cui lo spettrofotometro più comunemente usato e il rilevamento del metodo dell'elettroforesi su gel di agarosio.Va notato che questi due metodi devono essere utilizzati insieme per completare il rilevamento e l'analisi della concentrazione, della purezza e dell'integrità dell'RNA, in modo da garantire la qualità dell'RNA.

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Spettrofotometro:

Lo spettrofotometro viene utilizzato principalmente per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA, ma non è in grado di rilevare l'integrità dell'RNA e del residuo genomico.Tra questi, A260/280 e A260/230 sono parametri importanti per il rilevamento della purezza dell'RNA e la purezza dell'RNA può essere rilevata in base alla fluttuazione dei loro valori:

1. 1.9< A260/280< 2.1, che indica che la purezza dell'RNA è buona;A260/280<1.9, che indica che potrebbe esserci un residuo proteico nell'RNA;A260/280>2.1, che indica una possibile degradazione parziale dell'RNA, che può essere ulteriormente confermata dall'elettroforesi su gel di agarosio.

2. 2.0< A260/230< 2.2, indicando che la purezza dell'RNA è buona;A260/230< 2.0, indicando che potrebbero esserci residui di reagenti organici nell'RNA, come fenoli, etanolo o zuccheri.

Elettroforesi su gel di agarosio:

Il test di elettroforesi su gel di agarosio può analizzare l'integrità dell'RNA, il genoma e i residui proteici, ma non può quantificare con precisione la concentrazione di RNA o rilevare i residui di reagenti organici.Prendi ad esempio i modelli di RNA eucariotico:

1. L'RNA è stato sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio.Se sulla mappa del gel erano presenti solo tre singole bande di 28sRNA, 18sRNA e 5.8sRNA, ciò indica che l'RNA estratto è intatto.Se c'è un fenomeno di trascinamento, indica una parziale degradazione dell'RNA.

2. Se c'è una singola banda luminosa tra il foro della colla e la banda 28sRNA, potrebbe esserci un residuo di DNA genomico.

3. La presenza di bande nel foro della colla indica che potrebbero esserci residui di proteine ​​e altre sostanze macromolecolari.

Ⅱ. Trascrizione inversa

Dopo che l'estrazione dell'RNA è stata completata, deve essere invertita in cDNA per i successivi esperimenti, quindi la fase di inversione è essenziale.La trascrizione inversa sarà introdotta dalla selezione della trascrittasi inversa e del primer:

Selezione della trascrittasi inversa:

Le tipiche trascrittasi inverse includono AMV RTase e MMLV RTase.L'RNase H di AMV RTase ha una forte attività, una breve lunghezza di sintesi, una bassa quantità di sintesi e una buona stabilità termica (42 ~ 55 ℃).L'attività RNase H di MMLV RTase è debole, la lunghezza della sintesi è lunga, la quantità di sintesi è elevata e la stabilità termica è scarsa (37 ~ 42 ℃).

Poiché l'enzima RNase H ha la funzione di degradare il modello di RNA, MMLV con debole attività di RNase H dovrebbe essere selezionato preferenzialmente durante la trascrizione inversa e, dopo la successiva ingegneria genetica, la stabilità termica di MMLV ha raggiunto un salto qualitativo.Prendendo ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV per trascrizione inversa) ad esempio, si tratta di una nuova trascrittasi inversa espressa in batteri ingegnerizzati da E. coli utilizzando la tecnologia della ricombinazione genetica.È una DNA polimerasi ricombinante che sintetizza un filamento di DNA complementare da RNA a singolo filamento, DNA o un ibrido RNA:DNA.Non ha attività RNase H, forte stabilità, forte affinità dell'RNA e alta sensibilità di rilevamento.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV per trascrizione inversa)

Selezione del primer:

Generalmente i primer RT rientrano in tre categorie: oligo dT, primer casuali e primer gene-specifici.Selezionare i primer adatti per l'uso in base alle diverse esigenze sperimentali.

1. Se il templato è di origine eucariotica e il cDNA tardivo viene utilizzato per l'amplificazione PCR di routine, si consiglia Oligo (dT);Se l'esperimento successivo viene utilizzato solo per qPCR, si consiglia di miscelare Oligo (dT) con primer casuali per migliorare l'efficienza della trascrizione inversa.

2. Se il templato proviene da procarioti, per la trascrizione inversa devono essere selezionati primer casuali o primer gene-specifici.

Ⅲ.qPCR

La quantificazione della fluorescenza viene elaborata principalmente dalla selezione di metodi quantitativi, principi di progettazione dei primer, selezione ROX, configurazione del sistema di reazione e impostazione delle condizioni di reazione, ecc.

Selezione di metodi quantitativi:

I metodi quantitativi si dividono in metodi quantitativi relativi e metodi quantitativi assoluti.La quantificazione relativa può essere utilizzata per rilevare l'effetto di determinati metodi di trattamento sull'espressione genica, rilevare la differenza di espressione genica in momenti diversi e confrontare la differenza di espressione genica in diversi tessuti.La quantificazione assoluta può rilevare la quantità di acido nucleico nel virus e così via.Quando facciamo esperimenti, dobbiamo scegliere i metodi quantitativi appropriati in base ai nostri esperimenti.

Principi di progettazione del primer:

Il design del primer per qPCR è direttamente correlato all'efficienza di amplificazione e alla specificità del prodotto.Pertanto, progettare correttamente buoni primer è il primo passo per una qPCR di successo.Nella progettazione del primer, è necessario prestare attenzione ai seguenti principi quando si soddisfa il principio del design del primer convenzionale:

1. La lunghezza del frammento bersaglio è controllata tra 100 e 300 bp;

2. Progettazione cross-exon per evitare l'influenza del DNA genomico;

3. I primer progettati devono essere testati per l'efficienza di amplificazione e solo quando l'efficienza di amplificazione raggiunge lo standard (90-110%) possono essere utilizzati per esperimenti quantitativi;

4. La concentrazione del primer è generalmente ottimizzata tra 0,1 uM e 1,0 uM.

Selezione diROX:

Nel processo di reazione quantitativa, ROX può regolare uniformemente la differenza del percorso ottico, l'errore di pipettaggio o la differenza di volume causata dall'evaporazione e dalla condensazione, migliorando la ripetibilità dei risultati.Tuttavia, va notato che la selezione di ROX è correlata allo strumento.Se lo strumento qPCR ha la funzione di correggere automaticamente la differenza tra i fori, non è necessario aggiungere ROX;in caso contrario, è necessario aggiungere la correzione ROX.I piccoli partner nell'acquisto dei reagenti devono essere conformi allo strumento utilizzato per scegliere il ROX corretto, evitare errori successivi.

Preparazione del sistema di reazione:

Sono preferiti volumi di reazione di 20 ul e 50 ul.Quando si formula il sistema si dovrebbe prestare attenzione ai seguenti aspetti:

1. Il sistema di reazione deve essere preparato mediante ventilazione nel banco da lavoro ultra pulito, nuovo ddH₂O è usato per ogni esperimento;

2. Ogni esperimento deve preparare NTC per verificare se c'è inquinamento nel sistema e ogni coppia di primer deve fare NTC durante la preparazione del sistema;

3. Per rilevare se vi è residuo di gDNA nel modello di RNA, è possibile preparare NRT per ciascun campione per il rilevamento;

4. Durante la preparazione del sistema, si consiglia di eseguire almeno 3 ripetizioni tecniche per un campione;

5. Quando il modello è cDNA, si consiglia di diluire 5-10 volte per ridurre l'effetto di inibizione del sistema di trascrizione inversa sull'esperimento qPCR.È meglio esplorare la quantità del modello per gradiente, in modo che il valore CT sia compreso tra 20 e 30;

6. Determinare il numero richiesto di reazioni, aumentare del 5-10% in base al numero di reazioni e calcolare il numero di configurazione del volume;

7, il sistema viene preparato utilizzando il principio della premiscelazione, mescolando dopo la centrifugazione e garantendo l'assenza di bolle;

8, per quanto possibile scegliere materiali di consumo di supporto.

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