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Descrizioni

Questo kit utilizza un esclusivo sistema tampone di lisi in grado di rilasciare rapidamente l'RNA da campioni di cellule in coltura per le reazioni RT-qPCR, eliminando così il lungo e laborioso processo di purificazione dell'RNA.Il modello di RNA può essere ottenuto in soli 7 minuti.I reagenti 5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR forniti dal kit possono ottenere in modo rapido ed efficace risultati PCR quantitativi in ​​tempo reale.

5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR hanno una forte tolleranza agli inibitori e il lisato dei campioni può essere utilizzato direttamente come modello per RT-qPCR.Questo kit contiene l'esclusivo RNA Foregene trascrittasi inversa ad alta affinità e la DNA polimerasi Hot D-Taq, dNTP, MgCl₂, tampone di reazione, ottimizzatore e stabilizzatore PCR.

Specifiche

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Componenti del kit

Caratteristiche e vantaggi

■ Semplice ed efficace: con la tecnologia Cell Direct RT, i campioni di RNA possono essere ottenuti in soli 7 minuti.

■ La richiesta del campione è piccola, è possibile testare solo 10 celle.

■ Alta produttività: può rilevare rapidamente l'RNA nelle cellule coltivate in piastre da 384, 96, 24, 12, 6 pozzetti.

■ DNA Eraser può rimuovere rapidamente i genomi rilasciati, riducendo notevolmente l'impatto sui successivi risultati sperimentali.

■ Il sistema RT e qPCR ottimizzato rende la trascrizione inversa RT-PCR in due fasi più efficiente e la PCR più specifica e più resistente agli inibitori della reazione RT-qPCR.

Applicazione kit

Ambito di applicazione: cellule in coltura.

- RNA rilasciato dalla lisi del campione: applicabile solo al modello RT-qPCR di questo kit.

- Il kit può essere utilizzato per i seguenti scopi: analisi dell'espressione genica, verifica dell'effetto di silenziamento genico mediato da siRNA, screening di farmaci, ecc.

Diagramma

Conservazione e durata

La parte I di questo kit deve essere conservata a 4℃;La parte II deve essere conservata a -20 ℃.

Foregene Protease Plus II deve essere conservato a 4 ℃, non congelare a -20 ℃.

Il reagente 2×Direct qPCR Mix-SYBR deve essere conservato a -20℃ al buio;se usato frequentemente, può anche essere conservato a 4 ℃ per la conservazione a breve termine (consumare entro 10 giorni). Siamo stati produttori esperti.Vincere la maggioranza nelle certificazioni cruciali del suo mercato per il grande sconto China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, la qualità è la vita della fabbrica, l'attenzione alla domanda del cliente è la fonte della sopravvivenza e dello sviluppo dell'azienda, aderiamo all'onestà e all'atteggiamento di lavoro in buona fede, in attesa della tua venuta!
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QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Per RT-qPCR cellulare diretta utilizzando ≤ 1000.000 cellule

Introduzione al prodotto

Questo prodotto utilizza un esclusivo sistema tampone di lisi per rilasciare rapidamente l'RNA da campioni di cellule in coltura per le reazioni RT-qPCR, eliminando il lungo e laborioso processo di purificazione dell'RNA e solo 7 minuti per ottenere il modello di RNA richiesto, con 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman forniti dal kit possono ottenere in modo rapido ed efficiente risultati PCR quantitativi in ​​tempo reale.

5× Direct RT Mix e 2× Direct qPCR Mix-Taqman hanno una forte tolleranza agli inibitori e possono eseguire un'inversione efficiente e un'amplificazione specifica utilizzando il lisato del campione da misurare come templato.Il reagente contiene Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Buffer di reazione, Ottimizzatore PCR e Stabilizzatore, che può essere utilizzato con il tampone di lisi per rilevare rapidamente e facilmente i campioni e presenta le caratteristiche di elevata sensibilità, specificità e stabilità.

Caratteristiche del prodotto

Tecnologia Cell Direct RT semplice ed efficace che richiede solo 7 minuti per ottenere campioni di RNA.

I requisiti del campione sono piccoli e per la sperimentazione è possibile utilizzare un minimo di 10 cellule in coltura.

Alta produttività per una rapida acquisizione di RNA di cellule in coltura come piastre da 384, 96, 24, 12 e 6 pozzetti.

DNA Eraser è in grado di rimuovere rapidamente i genomi rilasciati, riducendo notevolmente l'impatto sui successivi risultati sperimentali.

I sistemi RT e qPCR ottimizzati consentono la RT-PCR in due fasi con trascrizione inversa più efficiente, specificità e maggiore tolleranza all'inibitore della reazione RT-qPCR.

Applicazione kit

Ambito di applicazione: Cellule coltivate.

Campione di lisi interpretato RNA: utilizzato solo come modello RT-qPCR in due fasi.

I kit possono essere utilizzati per i seguenti scopi: analisi dell'espressione regolatoria genica, test degli alleli, screening di farmaci, ecc.

Limitazioni del kit

Frammenti amplificati ≤ 300 bp.

I kit vengono utilizzati per coltivare cellule fresche.

Controllo di qualità del prodotto

Secondo il sistema di gestione della qualità totale di FOREGENE, ogni lotto di kit della serie Cell Direct RT-qPCR viene rigorosamente testato più volte per garantire l'affidabilità e la stabilità della qualità di ogni lotto di kit.

Contenuto del kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman possono essere acquistati separatamente, i dettagli sono forniti nell'Appendice 1 (PAGINA 13).

Condizioni di archiviazione

1. Condizioni di spedizione

L'intero processo di trasporto della scatola del ghiaccio a bassa temperatura, per garantire che il kit sia nello stato <4 °C.

2. Condizioni di conservazione

Conservare la parte I a 4°C e la parte II a -20°C.

Il Foregene Protease Plus II deve essere conservato a 4°C, non congelato a -20°C.

Il reagente 2× Direct qPCR Mix-Taqman viene conservato a -20°C oa 4°C per un uso a breve termine se utilizzato frequentemente (entro 10 giorni).

Informazioni sui componenti del kit

Buffer CL: fornisce l'ambiente necessario per le reazioni di lisi cellulare.

Tampone ST: termina la sostanza attiva nel lisato per evitare effetti sulla successiva RT.

DNA Eraser: rimozione del DNA, l'effetto della rimozione del genoma sugli esperimenti successivi.

5× Direct RT Mix: Contiene Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP, stabilizzatori, potenziatori, ottimizzatori e primer di trascrizione inversa per un allineamento ottimale (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: nel contesto del tampone di lisi, le cellule vengono sottoposte a lisi per rilasciare acidi nucleici.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: questo reagente contiene DNA polimerasi D-Taq calda, dNTP, MgCl₂, tampone di reazione, ottimizzatore PCR e stabilizzatore.

Colorante di riferimento 20× ROX: generalmente utilizzato su strumenti di amplificazione per PCR in tempo reale di ABI, Stratagene e altre società, viene utilizzato per regolare la differenza tra provette per PCR e provette causate da errori di dosaggio della PCR.La concentrazione del colorante di riferimento 20× ROX richiesta per diversi strumenti è diversa e l'utente può aggiungerla in base alla concentrazione consigliata dello strumento.

ddH senza RNasi₂O: Acqua ultrapura sterilizzata priva di RNasi per reazioni RT-qPCR in due fasi.

Precauzioni:(Assicurarsi di leggere attentamente le precauzioni prima di utilizzare il kit)

Prestare attenzione al metodo operativo dell'esperimento per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.

Prestare attenzione alla pulizia dell'ambiente sperimentale e degli utensili per evitare la contaminazione da RNasi e la degradazione dell'RNA.

Prelevare campioni di cellule fresche o ben conservate e non utilizzare mai ripetuti campioni di cellule congelate e scongelate.

5 × Direct qPCR Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman dovrebbe evitare ripetuti congelamento-scongelamento, altrimenti influenzerà la trascrizione inversa e l'efficienza della PCR.

PrepararazioniPrimaoperazione

Assicurarsi di leggere attentamente le istruzioni prima di utilizzare questo kit.Il kit Cell Direct RT-qPCR è semplice, comodo e veloce da utilizzare e le istruzioni forniscono informazioni complete sull'intero kit e su come utilizzarlo correttamente.Si prega di preparare i materiali e le attrezzature sperimentali necessari prima dell'uso.

Materiali e attrezzature sperimentali

◆ Cellule di coltura.

◆ Provetta da centrifuga priva di RNasi/DNasi da 1,5 ml o 2 ml, puntale privo di RNasi/DNasi, provetta qPCR sterile da 0,2 ml.

◆ macchina qPCR, pipetta, centrifuga da tavolo (≥13.400×g) (a seconda delle esigenze sperimentali), ecc.

Sicurezza

◆ Questo prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, si prega di non utilizzarlo per scopi farmaceutici, clinici, alimentari e cosmetici.

◆ Quando si utilizzano prodotti chimici, indossare indumenti da laboratorio, guanti, occhiali protettivi, ecc.

Operazioneguide

I sistemi di lisi cellulare, i sistemi RT e le confezioni di supplementi di soluzione di reazione qPCR possono essere acquistati separatamente, per i dettagli nell'Appendice 1 (PAGINA 13).

Guida operativa

A: Rilascio dell'RNA del campione

1.Le cellule sono state pretrattate: lavare la piastra di coltura cellulare con PBS freddo, quindi lisare le cellule (10-10⁶), 10⁶ rispetto alla quantità di cellule, si raccomanda Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) o Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) per l'estrazione e la purificazione dell'RNA.

1.1.Cellule aderenti (piastra a 24 pozzetti come esempio)

1.1.1.Determina il numero di celle in ciascun pozzetto, determina che il numero di celle è 1 × 10⁵e utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno di coltura dal piatto di coltura.

1.1.2.Aggiungere 200 ml di pre-raffreddato 1 × PBS in ciascun pozzetto.Non pipettare ripetutamente e rimuovere PBS dai pozzetti.Inclinare la piastra e rimuovere quanto più PBS possibile.Procedere al passaggio 2.

1.1.3.Un piatto di coltura cellulare diverso o una tabella dei numeri di riferimento 1-1 in un piatto di coltura cellulare è stato aggiunto preraffreddato 1 × PBS per il lavaggio cellulare.

Tabella 1-1: dosaggio PBS per diversi numeri di celle

Nota：Per garantire una ferma cellule aderenti，un gran numero di perdite di cellule evitate durante il lavaggio.

1.2.Cellule in sospensione o cellule aderenti coltivate in piastre non porose

1.2.1.Cellule aderenti coltivate in piastre non multi pozzetto (le cellule di sospensione iniziano dal passaggio successivo 1.2.2), raccolgono e separano le cellule secondo il normale metodo di raccolta delle cellule e le collocano in una piastra di coltura o in una provetta da centrifuga;se viene utilizzata la tripsinizzazione, richiedere la centrifugazione per raccogliere le cellule e rimuovere la tripsina residua, aggiungere cellule risospese PBS in singole cellule per disperdere le cellule.

1.2.2.Dopo il numero di celle contate, celle aliquotate 1 × 10⁵ uno per centrifugare le provette, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000 × g per 10 min.

1.2.3.Aggiungere 200 microlitri di PBS alla provetta da centrifuga, non pipettare ripetutamente e aspirare direttamente il PBS.procedere al passaggio 2. (Se è difficile precipitare e le cellule sono state risospese nuovamente, è possibile eseguire una centrifugazione a 1000 × g 10 minuti dopo aver scartato il surnatante, il pellet cellulare procedere al passaggio 2)

2.Lisi cellulare: rimuovere il tampone CL, la sua temperatura equilibrata a temperatura ambiente, DNA Eraser e Foregene Protease Plus II, secondo la seguente tabella 1-2 sistema di lisi preparato: (la soluzione di lisi è pronta per l'uso).

Tabella 1-2: scissione preparazione impianto (Nota: nella preparazione su ghiaccio)

3. (Piastra da 24 pozzetti come esempio) Pipettare 200 μl di master mix di lisi cellulare in ciascun pozzetto, soffiare ripetutamente 5-10 volte, incubare a temperatura ambiente (20-25 ℃) per 5 min.

Nota：Per evitare la formazione di bolle, quando si pipetta la scala della pipetta è stata regolata a 200μl o meno.Le cellule possono apparire torbide dopo la lisi, il che è normale.

4. (Piastra a 24 pozzetti come esempio) viene aggiunto nel liquido 20 μl Buffer ST (diversi sistemi di lisi Buffer ST aggiunti in una quantità mostrata nella Tabella 1-3), pipettaggio ripetuto 5-10 volte, a temperatura ambiente (20-25 ℃) sono stati incubati per 2 min.

Nota：La punta della pipetta disposta sotto la superficie, assicurando che il lisato è stato aggiunto，per evitare la formazione di bolle, quando si pipetta la scala della pipetta è stata regolata a 200 μl o meno.

Tabella 1-3：Aggiungi tampone ST

5.Il lisato viene utilizzato per i successivi esperimenti RT-qPCR.Se i successivi esperimenti non possono essere eseguiti in tempo, si prega di tenerlo in ghiaccio per non più di 2 ore e conservare a -20 ℃ o -80 ℃ (non più di tre mesi).

B: Preparazione del sistema RT

1. Estrarre 5 × Direct RT Mix e metterlo su un bagno di ghiaccio, lasciarlo sciogliere naturalmente e mescolarlo delicatamente per un uso successivo;estrarre ddH2O RNase-Free e scioglierlo e metterlo su un bagno di ghiaccio per un uso successivo.Preparare il sistema di reazione su ghiaccio secondo la Tabella 2-1 di seguito.

Tabella 2-1: Preparazione del sistema di reazione RT

2.Dopo il completamento della formulazione del sistema, miscelare delicatamente e centrifugare brevemente nella seguente tabella 2 -2 condizioni di reazione reazione RT.

Tabella 2-2: Impostazione della condizione di reazione RT

3. Dopo il completamento della reazione, il prodotto di reazione è stato posto direttamente sul ghiaccio per qPCR, si prega di inserire la conservazione a lungo termine -20 ℃ o -80 ℃.

Nota: a causa dell'uso di templato non purificato, nel prodotto di trascrizione inversa possono comparire precipitati bianchi.Questo è un fenomeno normale.Centrifugare immediatamente il surnatante per i successivi esperimenti.

La soluzione di reazione RT risultante viene aggiunta ai sistemi di reazione PCR in tempo reale della fase successiva, si consiglia di aggiungere quantità comprese tra il 10 e il 30% del sistema di reazione.

C: preparazione del sistema di reazione qPCR

1.Quantità appropriata di B preparata nel passaggio stampo di cDNA secondo la seguente tabella 3-1 per preparare un sistema di reazione.

Nota: la quantità di modello cDNA rappresenta il 10-30% del sistema qPCR.Ad esempio, in un sistema qPCR da 20 μl, aggiungere 2-6 μl di tampone di lisi, ma non più di 6 μl.

2. Ottimizzazione delle buone condizioni qPCR (temperatura di ricottura, ecc.) per la reazione qPCR (le condizioni di reazione indicate nella Tabella 3-2).

Nota: provare a utilizzare condizioni ottimizzate per le reazioni qPCR per ottenere risultati migliori.

Tabella 3-1: Preparazione del sistema di reazione PCR

1*: la concentrazione del primer può essere regolata nell'intervallo 50-900 nM quando le prestazioni della reazione del primer sono scarse.

Nota: il sistema qPCR può essere regolato in base alle esigenze sperimentali e al modello di cycler a fluorescenza.Per qPCR in un 50μl sistema, regolare il dosaggio del reagente proporzionalmente secondo il 20μsistema l.

2*: selezionare la concentrazione finale appropriata del colorante di riferimento ROX in base al termociclatore quantitativo a fluorescenza.Le concentrazioni di colorante di riferimento ROX più appropriate per i comuni ciclatori quantitativi a fluorescenza sono mostrate nella tabella seguente:

Tabella 3-2: Vengono fornite le condizioni di reazione qPCR

Nota: per ottenere il miglior effetto qPCR, è possibile utilizzare la PCR gradiente per ottimizzare le condizioni di reazione per diversi modelli e diversi primer.Le condizioni di reazione della PCR variano a seconda dell'analizzatore di fluorescenza, del modello, del primer, ecc. Nell'operazione specifica, le condizioni di reazione ottimali devono essere progettate in base alle condizioni specifiche del termociclatore quantitativo a fluorescenza, al tipo di modello, alla dimensione del frammento di interesse, alla sequenza di basi del frammento amplificato e al contenuto di GC e alla lunghezza dei primer, inclusa la temperatura di ricottura, il tempo di reazione, ecc.

Principi di progettazione dei primer per PCR in tempo reale

Primer in avanti e primer inverso

Per la Real Time PCR, il design del primer è molto importante.I primer sono correlati alla specificità e all'efficienza dell'amplificazione PCR e possono essere progettati con riferimento ai seguenti principi:

◆ Lunghezza del primer: 18-30 bp.

◆ Contenuto in GC: 40-60%.

◆ Valore Tm: il software di progettazione del primer, come Primer 5, può fornire il valore Tm del primer.I valori Tm dei primer a monte ea valle dovrebbero essere il più vicini possibile.Si può utilizzare anche la formula di calcolo Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Quando si esegue la PCR, viene generalmente selezionata come temperatura di ricottura una temperatura inferiore al valore Tm del primer di 5 °C (il corrispondente aumento della temperatura di ricottura può aumentare la specificità della reazione PCR).

◆ Primer e prodotti PCR:

◆ La lunghezza del prodotto di amplificazione PCR del primer di progettazione è preferibilmente di 100-150 bp.

◆ I primer di design nell'area strutturale secondaria del modello dovrebbero essere evitati il ​​più possibile.

◆ Evitare la formazione di 2 o più basi complementari tra le estremità 3′ dei primer a monte ea valle.

◆ Base terminale Primer 3′ non può essere presente con 3 G o C consecutivi aggiuntivi.

◆ I primer stessi non possono avere strutture complementari, altrimenti si formerà una struttura a forcina che influirà sull'amplificazione PCR.

◆ ATCG dovrebbe essere distribuito il più uniformemente possibile nella sequenza dei primer, e la base terminale 3′ dovrebbe essere evitata come T.

Appendice1：Cell direttoRT-qPCR Kit comppacchetto supplemento t

1.Soluzione per la lisi cellulare