La PCR quantitativa a fluorescenza (nota anche come TaqMan PCR, di seguito denominata FQ-PCR) è una nuova tecnologia quantitativa dell'acido nucleico sviluppata da PE (Perkin Elmer) negli Stati Uniti nel 1995. Questa tecnologia si basa sulla PCR convenzionale mediante l'aggiunta di sonde marcate con fluorescenza.Rispetto alla PCR flessibile, FQ-PCR presenta molti vantaggi per realizzare la sua funzione quantitativa.Questo articolo intende descrivere brevemente le caratteristiche, i principi, i metodi e le applicazioni della tecnologia.
1 Caratteristiche
FQ-PCR non solo ha l'elevata sensibilità della PCR ordinaria, ma anche grazie all'applicazione di sonde fluorescenti, può rilevare direttamente il cambiamento del segnale fluorescente durante l'amplificazione della PCR attraverso il sistema di conduzione fotoelettrica per ottenere risultati quantitativi, che supera molte carenze della PCR convenzionale, quindi ha anche l'elevata specificità dell'ibridazione del DNA e l'elevata precisione della tecnologia spettroscopica.
Ad esempio, i prodotti PCR generali devono essere osservati mediante elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con bromuro di etidio con luce ultravioletta o mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione con argento.Ciò non solo richiede più strumenti, ma richiede anche tempo e fatica.Le macchie utilizzate Il bromuro di etidio è dannoso per il corpo umano e queste complicate procedure sperimentali offrono opportunità di inquinamento e falsi positivi.Tuttavia, FQ-PCR deve solo aprire il coperchio una volta durante il caricamento del campione e il processo successivo è un'operazione completamente a provetta chiusa, che non richiede la post-elaborazione della PCR, evitando molti inconvenienti nelle operazioni di PCR convenzionali.L'esperimento utilizza generalmente il termociclatore PCR ABI7100 sviluppato dalla società PE.
Lo strumento ha le seguenti caratteristiche: ① Ampia applicazione: può essere utilizzato per la quantificazione del prodotto PCR di DNA e RNA, la ricerca sull'espressione genica, il rilevamento di agenti patogeni e l'ottimizzazione delle condizioni di PCR.② Principio quantitativo unico: utilizzando sonde con etichetta fluorescente, la quantità di fluorescenza si accumulerà con il ciclo PCR dopo l'eccitazione del laser, in modo da raggiungere lo scopo della quantificazione.③ Elevata efficienza di lavoro: termociclatore PCR 9600 incorporato, controllato da computer da 1 a 2 ore per completare l'amplificazione e la quantificazione di 96 campioni in modo automatico e sincrono.④ Non è necessaria l'elettroforesi su gel: non è necessario diluire ed eseguire l'elettroforesi del campione, basta utilizzare una sonda speciale per rilevare direttamente nel tubo di reazione.⑤Nessun inquinamento nella pipeline: vengono adottati l'esclusivo tubo di reazione completamente chiuso e il sistema di conduzione fotoelettrica, quindi non è necessario preoccuparsi dell'inquinamento.⑥I risultati sono riproducibili: l'intervallo dinamico quantitativo è fino a cinque ordini di grandezza.Pertanto, poiché questa tecnologia è stata sviluppata con successo, è stata apprezzata da molti ricercatori scientifici ed è stata applicata in molti campi.
2 Principi e metodi
Il principio di funzionamento della FQ-PCR consiste nell'utilizzare l'attività esonucleasica 5′→3′ dell'enzima Taq per aggiungere una sonda marcata in modo fluorescente al sistema di reazione PCR.La sonda può ibridarsi in modo specifico con lo stampo di DNA contenuto nella sequenza del primer.L'estremità 5' della sonda è etichettata con il gene di emissione di fluorescenza FAM (6-carbossifluoresceina, picco di emissione di fluorescenza a 518 nm) e l'estremità 3' è etichettata con il gruppo di spegnimento della fluorescenza TAMRA (6-carbossitetrametilrodamina, picco di emissione di fluorescenza a 582 nm), l'inizio 3' della sonda è fosforilato per evitare che la sonda venga estesa durante l'amplificazione PCR.Quando la sonda rimane intatta, il gruppo quencher sopprime l'emissione di fluorescenza del gruppo emittente.Una volta che il gruppo emittente è separato dal gruppo di spegnimento, l'inibizione viene revocata e la densità ottica a 518 nm aumenta e viene rilevata dal sistema di rilevamento della fluorescenza.Quando la sonda viene tagliata, viene rilasciato l'effetto di spegnimento e viene rilasciato il segnale fluorescente.Ogni volta che il modello viene copiato, una sonda viene tagliata, accompagnata dal rilascio di un segnale fluorescente.Poiché esiste una relazione uno a uno tra il numero di fluorofori rilasciati e il numero di prodotti PCR, questa tecnica può essere utilizzata per quantificare con precisione il modello.Lo strumento sperimentale utilizza generalmente il termociclatore PCR ABI7100 sviluppato dalla società PE e possono essere utilizzati anche altri termociclatori.Se per l'esperimento viene utilizzato il sistema di reazione del tipo di reazione ABI7700, dopo che la reazione è stata completata, i risultati quantitativi possono essere forniti direttamente tramite l'analisi del computer.Se si utilizzano altri termociclatori, è necessario utilizzare un rilevatore di fluorescenza per misurare contemporaneamente il segnale di fluorescenza nel tubo di reazione per calcolare RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ rappresenta il rapporto tra l'intensità di luminescenza del gruppo di emissione fluorescente della provetta campione e l'intensità di luminescenza del gruppo di spegnimento, RQ- rappresenta il rapporto dei due nella provetta vuota, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) rappresenta la quantità di variazione del segnale di fluorescenza durante la PCR Dopo l'elaborazione dei dati, è possibile ottenere risultati quantitativi.Grazie all'introduzione di sonde fluorescenti, la specificità dell'esperimento è notevolmente migliorata.Il design della sonda dovrebbe generalmente soddisfare le seguenti condizioni: ①La lunghezza della sonda dovrebbe essere di circa 20-40 basi per garantire la specificità del legame.②Il contenuto di basi GC è compreso tra il 40% e il 60% per evitare la duplicazione di singole sequenze nucleotidiche.③ Evitare l'ibridazione o la sovrapposizione con i primer.④ La stabilità del legame tra la sonda e il templato è maggiore della stabilità del legame tra primer e templato, pertanto il valore Tm della sonda deve essere superiore di almeno 5°C rispetto al valore Tm del primer.Inoltre, la concentrazione della sonda, l'omologia tra la sonda e la sequenza dello stampo e la distanza tra la sonda e il primer hanno tutti un impatto sui risultati sperimentali.
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Tempo di pubblicazione: 15 ottobre 2021
