Guide per l'analisi dei problemi

The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。

Nessun RNA può essere estratto o la resa di acido nucleico è bassa

Di solito ci sono molti fattori che influenzano l'efficienza del recupero, come: contenuto di RNA del campione, metodo di funzionamento, volume di eluizione, ecc.

Analisi delle cause comuni：

1.Bagno di ghiaccio o centrifugazione a bassa temperatura (4 °C) durante il funzionamento.

Suggerimento: funzionamento a temperatura ambiente (15-25 °C), mai bagno di ghiaccio e centrifuga a bassa temperatura.

2. Conservazione impropria del campione o conservazione del campione troppo lunga.

Suggerimento: conservare i campioni a -80 ° C o congelarli in azoto liquido ed evitare l'uso ripetuto di congelamento e scongelamento;provare a utilizzare campioni appena raccolti per l'estrazione dell'RNA.

3.Lisi del campione insufficiente

Raccomandazione: assicurarsi che il campione e la soluzione di lavoro (acrilammide lineare) siano stati accuratamente miscelati e incubati per 10 minuti a temperatura ambiente (15-25 ° C)

4.L'eluente è stato aggiunto in modo errato

Raccomandazione: assicurarsi che ddH2O privo di RNasi sia aggiunto al centro della membrana della colonna di purificazione

5.Volume improprio di etanolo anidro nel tampone viRW2

Suggerimento: seguire le istruzioni, aggiungere il volume corretto di etanolo anidro al tampone viRW2 e miscelare bene prima di utilizzare il kit.

6. Utilizzo improprio del campione.

Suggerimento: 200μl di campione per 500μl di Buffer viRL.Un volume di campione eccessivo comporterà una riduzione della velocità di estrazione dell'RNA.

7.Volume di eluizione improprio o eluizione incompleta.

Suggerimento: il volume dell'eluente della colonna di purificazione è di 30-50 μl;se l'effetto di eluizione non è soddisfacente, si consiglia di aggiungere ddH RNase-Free preriscaldato₂O ed estendere il tempo di posizionamento a temperatura ambiente, ad esempio 5-10 minuti

8. La colonna di purificazione presenta residui di etanolo dopo il risciacquo nel tampone viRW2.

Suggerimento: se l'etanolo rimane ancora dopo il risciacquo nel tampone viRW2 e la centrifugazione a tubo vuoto per 2 minuti, la colonna di purificazione può essere lasciata a temperatura ambiente per 5 minuti dopo la centrifugazione a tubo vuoto per rimuovere completamente l'etanolo rimanente.

La degradazione delle molecole di RNA purificato

La qualità dell'RNA purificato è correlata a fattori quali la conservazione del campione, la contaminazione da RNasi e il funzionamento.

Analisi delle cause comuni：

1. I campioni raccolti non sono stati salvati in tempo.

Suggerimento: se il campione non viene utilizzato in tempo dopo la raccolta, conservarlo immediatamente a -80 ℃ o azoto liquido.Per l'estrazione di molecole di RNA, cercare di utilizzare campioni appena raccolti quando possibile.

2. I campioni raccolti venivano congelati e scongelati ripetutamente.

Suggerimento: evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuto (non più di una volta) durante la raccolta e la conservazione del campione, altrimenti la resa di acido nucleico diminuirà.

3. L'RNasi è stata introdotta in sala operatoria o non sono stati indossati guanti monouso, maschere, ecc.

Suggerimento: l'esperimento di estrazione delle molecole di RNA viene eseguito al meglio in una sala operatoria separata dell'RNA e il tavolo sperimentale viene pulito prima dell'esperimento.Indossare guanti e maschere monouso durante l'esperimento per evitare la degradazione dell'RNA causata dall'introduzione di RNasi.

4.Il reagente è contaminato da RNasi durante l'uso.

Suggerimento: sostituire con il nuovo kit di isolamento dell'RNA virale per gli esperimenti correlati.

5. La contaminazione da RNasi delle provette per centrifuga, dei puntali delle pipette, ecc. Suggerimento: assicurarsi che le provette per centrifuga, i puntali delle pipette e le pipette siano tutti privi di RNasi.

Le molecole di RNA purificate hanno influenzato gli esperimenti a valle

Le molecole di RNA purificate dalla colonna di purificazione influenzeranno gli esperimenti a valle se ci sono troppi ioni salini o proteine, come: trascrizione inversa, Northern Blot, ecc.

1. Ci sono ioni salini rimanenti nelle molecole di RNA eluite.

Raccomandazione: assicurarsi che il volume corretto di etanolo anidro sia stato aggiunto al tampone viRW2 e lavare la colonna di purificazione due volte in base alla velocità di centrifugazione corretta indicata nelle istruzioni operative; se sono ancora presenti ioni salini, è possibile aggiungere il tampone viRW2 alla colonna di purificazione e lasciarla a temperatura ambiente per 5 minuti.Quindi eseguire la centrifugazione per rimuovere al massimo la contaminazione da ioni salini

2. Ci sono residui di etanolo nelle molecole di RNA eluite

Suggerimento: una volta verificato che le colonne di purificazione sono state risciacquate dal tampone viRW2, eseguire la centrifugazione a provetta vuota in base alla velocità di centrifuga indicata nelle istruzioni operative.Se c'è ancora etanolo rimanente, può essere lasciato per 5 minuti a temperatura ambiente dopo una centrifugazione a provetta vuota per rimuovere il più possibile l'etanolo rimanente.

Manuali di istruzioni:

Manuale di istruzioni del kit di isolamento dell'RNA virale