Escherichia Coli O157: kit di rilevamento dell'acido nucleico H7 (metodo della sonda fluorescente PCR/liofilizzazione)
Descrizione del corredo:
Cat.No.FP103
Viene utilizzato per il rilevamento rapido e lo screening di E. coli O157:H7 in alimenti, mangimi, campioni di acqua e campioni ambientali.
Descrizioni
È usato perrilevamento rapido e screening di E. coli O157:H7 in alimenti, mangimi, campioni di acqua e campioni ambientali.
[Principio di prova]
Secondo il principio della tecnologia PCR fluorescente, i primer specifici e le sonde Taqman sono progettati per il gene specifico di Escherichia coli O157: H7 e rilevati da uno strumento PCR fluorescente, in modo da realizzare il rilevamento di Escherichia coli O157: H7 Rilevamento qualitativo del DNA.
Contenuto del kit
Nota: la sonda del canale ROX non è inclusa.
| Ccomponenti | Specifica | Qquantità |
| Tampone A | Tubo | 1 |
| Tampone B | Tubo | 1 |
| Controllo positivo | Tubo | 1 |
| Controllo negativo | Tubo | 1 |
Utilizzo previsto
È usato per rilevamento rapido e screening di E. coli O157:H7 in alimenti, mangimi, campioni di acqua e campioni ambientali.
Condizioni di conservazione e data di scadenza
Conservare a -20 ℃ al buio ed evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
Il periodo di validità è 12mesi e la data di produzione è riportata sulla confezione esterna.
Strumenti e materiali di consumo
Strumento fluorescente per PCR quantitativa, pistola per pipette e puntali corrispondenti, agitatore vortex, minicentrifuga.
Utilizzo
1. Elaborazione del campione
1.1 Tipo di campione: questo kit è adatto per alimenti, mangimi, campioni di acqua e altri campioni sospettati di essere contaminati da Escherichia coli O157:H7.Per i prodotti a base di carne lavorata in profondità, le bevande e altre sostanze contenenti pigmenti, devono essere risciacquati per evitare di influenzare la raccolta del segnale di fluorescenza.
1.2 Elaborazione del campione: fare riferimento a "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" per la preparazione del campione, la coltura di arricchimento e l'isolamento di Escherichia coli O157: H7.
- Nestrazione dell'acido ucleico
Prendere 20 mL di soluzione di arricchimento in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, aggiungere 200 μL di lisato microbico (è necessario un kit aggiuntivo), vortexare per 30 secondi, centrifugare brevemente e mettere da parte.
Osservazioni: l'estrazione dell'acido nucleico dal lisato deve essere completata entro 10 minuti e non può essere conservata a lungo.
3. Amplificazione dell'acido nucleico
3.1 Accendere lo strumento PCR quantitativo fluorescente per l'uso.
Buffer A e Buffer B del kit, scioglierli bene e centrifugare brevemente.Aggiungere 18 μL di tampone A e 2 μL di tampone B a ciascuna provetta di reazione PCR.Quindi aggiungere 5 mL ciascuno del controllo negativo, dell'acido nucleico estratto e del controllo positivo nelle provette di reazione PCR, tappare le provette e centrifugare brevemente.
3.3 Trasferire la provetta di reazione PCR in una macchina PCR fluorescente e utilizzare le seguenti procedure per eseguire esperimenti di amplificazione: selezionare 25 mL per il sistema di reazione, raccogliere segnali di fluorescenza a 60°C per ciascun ciclo e selezionare FAM per il canale di rilevamento.
| Fare un passo | Programma | Numero di cicli |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15 sec | 4 0 |
| 60℃ 30s (raccoglie fluorescenza) |
Guide per l'analisi dei problemi
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nessun RNA può essere estratto o la resa di acido nucleico è bassa
Di solito ci sono molti fattori che influenzano l'efficienza del recupero, come: contenuto di RNA del campione, metodo di funzionamento, volume di eluizione, ecc.
Analisi delle cause comuni：
1.Bagno di ghiaccio o centrifugazione a bassa temperatura (4 °C) durante il funzionamento.
Suggerimento: funzionamento a temperatura ambiente (15-25 °C), mai bagno di ghiaccio e centrifuga a bassa temperatura.
2. Conservazione impropria del campione o conservazione del campione troppo lunga.
Suggerimento: conservare i campioni a -80 ° C o congelarli in azoto liquido ed evitare l'uso ripetuto di congelamento e scongelamento;provare a utilizzare campioni appena raccolti per l'estrazione dell'RNA.
3.Lisi del campione insufficiente
Raccomandazione: assicurarsi che il campione e la soluzione di lavoro (acrilammide lineare) siano stati accuratamente miscelati e incubati per 10 minuti a temperatura ambiente (15-25 ° C)
4.L'eluente è stato aggiunto in modo errato
Raccomandazione: assicurarsi che ddH2O privo di RNasi sia aggiunto al centro della membrana della colonna di purificazione
5.Volume improprio di etanolo anidro nel tampone viRW2
Suggerimento: seguire le istruzioni, aggiungere il volume corretto di etanolo anidro al tampone viRW2 e miscelare bene prima di utilizzare il kit.
6. Utilizzo improprio del campione.
Suggerimento: 200μl di campione per 500μl di Buffer viRL.Un volume di campione eccessivo comporterà una riduzione della velocità di estrazione dell'RNA.
7.Volume di eluizione improprio o eluizione incompleta.
Suggerimento: il volume dell'eluente della colonna di purificazione è di 30-50 μl;se l'effetto di eluizione non è soddisfacente, si consiglia di aggiungere ddH RNase-Free preriscaldato2O ed estendere il tempo di posizionamento a temperatura ambiente, ad esempio 5-10 minuti
8. La colonna di purificazione presenta residui di etanolo dopo il risciacquo nel tampone viRW2.
Suggerimento: se l'etanolo rimane ancora dopo il risciacquo nel tampone viRW2 e la centrifugazione a tubo vuoto per 2 minuti, la colonna di purificazione può essere lasciata a temperatura ambiente per 5 minuti dopo la centrifugazione a tubo vuoto per rimuovere completamente l'etanolo rimanente.
La degradazione delle molecole di RNA purificato
La qualità dell'RNA purificato è correlata a fattori quali la conservazione del campione, la contaminazione da RNasi e il funzionamento.
Analisi delle cause comuni：
1. I campioni raccolti non sono stati salvati in tempo.
Suggerimento: se il campione non viene utilizzato in tempo dopo la raccolta, conservarlo immediatamente a -80 ℃ o azoto liquido.Per l'estrazione di molecole di RNA, cercare di utilizzare campioni appena raccolti quando possibile.
2. I campioni raccolti venivano congelati e scongelati ripetutamente.
Suggerimento: evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuto (non più di una volta) durante la raccolta e la conservazione del campione, altrimenti la resa di acido nucleico diminuirà.
3. L'RNasi è stata introdotta in sala operatoria o non sono stati indossati guanti monouso, maschere, ecc.
Suggerimento: l'esperimento di estrazione delle molecole di RNA viene eseguito al meglio in una sala operatoria separata dell'RNA e il tavolo sperimentale viene pulito prima dell'esperimento.Indossare guanti e maschere monouso durante l'esperimento per evitare la degradazione dell'RNA causata dall'introduzione di RNasi.
4.Il reagente è contaminato da RNasi durante l'uso.
Suggerimento: sostituire con il nuovo kit di isolamento dell'RNA virale per gli esperimenti correlati.
5. La contaminazione da RNasi delle provette per centrifuga, dei puntali delle pipette, ecc. Suggerimento: assicurarsi che le provette per centrifuga, i puntali delle pipette e le pipette siano tutti privi di RNasi.
Le molecole di RNA purificate hanno influenzato gli esperimenti a valle
Le molecole di RNA purificate dalla colonna di purificazione influenzeranno gli esperimenti a valle se ci sono troppi ioni salini o proteine, come: trascrizione inversa, Northern Blot, ecc.
1. Ci sono ioni salini rimanenti nelle molecole di RNA eluite.
Raccomandazione: assicurarsi che il volume corretto di etanolo anidro sia stato aggiunto al tampone viRW2 e lavare la colonna di purificazione due volte in base alla velocità di centrifugazione corretta indicata nelle istruzioni operative; se sono ancora presenti ioni salini, è possibile aggiungere il tampone viRW2 alla colonna di purificazione e lasciarla a temperatura ambiente per 5 minuti.Quindi eseguire la centrifugazione per rimuovere al massimo la contaminazione da ioni salini
2. Ci sono residui di etanolo nelle molecole di RNA eluite
Suggerimento: una volta verificato che le colonne di purificazione sono state risciacquate dal tampone viRW2, eseguire la centrifugazione a provetta vuota in base alla velocità di centrifuga indicata nelle istruzioni operative.Se c'è ancora etanolo rimanente, può essere lasciato per 5 minuti a temperatura ambiente dopo una centrifugazione a provetta vuota per rimuovere il più possibile l'etanolo rimanente.
Manuali di istruzioni:
Manuale di istruzioni del kit di isolamento dell'RNA virale
