Sterilizzazione di puntali per pipette e tubi EP, ecc.
1. Preparare lo 0,1% (un millesimo) di DEPC (sostanza altamente tossica) con acqua deionizzata, usarlo con cura sotto una cappa aspirante e conservarlo a 4°C lontano dalla luce;
L'acqua DEPC è acqua pura trattata con DEPC e sterilizzata ad alta temperatura e alta pressione.Testato per essere privo di RNasi, DNasi e proteinasi.
2. Mettere la punta della pipetta e la provetta EP in DEPC allo 0,1% e assicurarsi che la punta della pipetta e la provetta EP siano riempite con DEP allo 0,1%.
3. Proteggere dalla luce, lasciare riposare, durante la notte (12-24 ore)
4. La scatola contenente la punta e il tubo EP non necessita di essere imbevuta di DEPC.Dopo aver rimosso grossolanamente l'acqua DEPC dalla punta o dal tubo EP, impacchettarlo e avvolgerlo.
5. 121 gradi Celsius, 30 min
6. 180 gradi Celsius, asciugare per diverse ore (almeno 3 ore)
Nota: un.Indossa guanti e maschere in lattice quando maneggi il DEPC!b, o senza sterilizzazione DEPC, 130 ℃, autoclave da 90 minuti (molti laboratori sterilizzazione ad alta temperatura due volte)
Considerazioni sull'estrazione dell'RNA
Due principali fenomeni di fallimento dell'isolamento dell'RNA tissutale
degradazione dell'RNA e residui di impurità nei tessuti,per quanto riguarda la degradazione, diamo prima un'occhiata al motivo per cui l'RNA estratto dalle cellule in coltura non è facilmente degradabile.I reagenti di estrazione dell'RNA esistenti contengono tutti componenti che inibiscono rapidamente l'RNasi.Aggiungere il lisato alle cellule in coltura e semplicemente mescolarlo, tutte le cellule possono essere accuratamente miscelate con il lisato e le cellule vengono completamente lisate.Dopo che le cellule sono state lisate, i principi attivi nel lisato inibiscono immediatamente l'RNasi intracellulare, quindi l'RNA rimane intatto.Vale a dire, poiché le cellule in coltura sono facilmente e completamente messe in contatto con il lisato, il loro RNA non viene facilmente degradato;d'altra parte, l'RNA nel tessuto è facilmente degradato perché le cellule nel tessuto non sono facili da contattare rapidamente il lisato.a causa di un contatto sufficiente.COSÌ,supponendo che esista un modo per trasformare il tessuto in una singola cellula inibendo l'attività dell'RNA, il problema della degradazione potrebbe essere completamente risolto.
La macinazione dell'azoto liquido è il metodo più efficace.Tuttavia, il metodo di macinazione con azoto liquido è molto problematico, soprattutto quando il numero di campioni è elevato.Ciò ha dato origine alla prossima cosa migliore: l'omogeneizzatore.ILomogeneizzatoreIl metodo non considera la questione di come l'attività dell'RNasi viene inibita prima che le cellule vengano messe in contatto con il lisato, ma piuttosto prega che la velocità di rottura del tessuto sia più veloce della velocità con cui l'RNasi intracellulare degrada l'RN.
L'effetto dell'omogeneizzatore elettrico è migliore,e l'effetto dell'omogeneizzatore di vetro è scarso, ma in generale il metodo dell'omogeneizzatore non può prevenire il fenomeno del degrado.Pertanto, se l'estrazione è degradata, l'omogeneizzatore elettrico originale dovrebbe essere utilizzato per la macinazione con azoto liquido;l'omogeneizzatore di vetro originale dovrebbe essere cambiato in un omogeneizzatore elettrico o macinato direttamente con azoto liquido.Il problema è fattibile quasi al 100%.risolversi.
Il problema dei residui di impurità che interessano gli esperimenti successivi ha cause più diverse rispetto al degrado e le soluzioni sono corrispondentemente diverse.Insomma,se c'è degradazione o impurità residue nel tessuto, il metodo/reagente di estrazione per il materiale sperimentale specifico deve essere ottimizzato.Non devi utilizzare i tuoi preziosi campioni per l'ottimizzazione: puoi acquistare alcuni piccoli animali come pesce/pollo dal mercato, prendere la parte corrispondente del materiale per l'estrazione dell'RNA e l'altra parte per l'estrazione delle proteine - macinare con Estratto di bocca, stomaco e intestino.
L'RNA target dell'RNA estratto viene utilizzato per diversi esperimenti di follow-up e i suoi requisiti di qualità sono diversi
la costruzione della libreria cDNA richiede l'integrità dell'RNA senza residui di inibitori della reazione enzimatica;Northern richiede una maggiore integrità dell'RNA e requisiti inferiori per i residui degli inibitori della reazione enzimatica;RT-PCR non richiede un'integrità dell'RNA troppo elevata,ma inibisce le reazioni enzimatiche.I requisiti sui residui sono severi.L'input determina l'output;ogni volta che l'obiettivo è ottenere l'RNA della massima purezza, costerà persone e denaro.
Raccolta/conservazione dei campioni
Fattori che influenzano la degradazione Dopo che il campione ha lasciato il corpo vivente/o l'ambiente di crescita originale, gli enzimi endogeni nel campione inizieranno a degradare l'RNA,e la velocità di degradazione è correlata al contenuto di enzimi endogeni e alla temperatura.Tradizionalmente, ci sono solo due modi per inibire completamente l'attività enzimatica endogena: aggiungere immediatamente il lisato e omogeneizzare completamente e rapidamente;tagliare a pezzetti e congelare immediatamente in azoto liquido.Entrambi gli approcci richiedono operazioni rapide.Quest'ultimo è adatto a tutti i campioni, mentre il primo è adatto solo per tessuti a basso contenuto di cellule ed enzimi endogeni e più facili da omogeneizzare.In particolare, è meglio congelare il tessuto vegetale, fegato, timo, pancreas, milza, cervello, grasso, tessuto muscolare, ecc. con azoto liquido prima di procedere.
Frammentazione e omogeneizzazione dei campioni
Fattori che influenzano la degradazione e la resa La frammentazione del campione èper una completa omogeneizzazione, che è per il rilascio completo e completo di RNA.Le cellule possono essere omogeneizzate direttamente senza essere rotte.I tessuti possono essere omogeneizzati solo dopo essere stati rotti.Lievito e batteri devono essere rotti con gli enzimi corrispondenti prima che possano essere omogeneizzati.I tessuti con un contenuto di enzimi endogeni inferiore e una più facile omogeneizzazione possono essere frantumati e omogeneizzati contemporaneamente nel lisato da un omogeneizzatore;tessuto vegetale, fegato, timo, pancreas, milza, cervello, grasso, tessuto muscolare e altri campioni, sono ricchi di enzimi endogeni o non sono facilmente omogeneizzati,quindi la rottura del tessuto e l'omogeneizzazione devono essere eseguite separatamente.Il metodo di frammentazione più affidabile e produttivo è la macinazione con azoto liquido e il metodo di omogeneizzazione più affidabile è l'uso di un omogeneizzatore elettrico.Una nota speciale sulla macinazione con azoto liquido: il campione non deve essere scongelato durante l'intero processo di macinazione, poiché è più probabile che gli enzimi endogeni funzionino una volta congelati.
Scelta del lisato
Influenza sulla praticità d'uso e sui fattori di impurità endogene residue Le soluzioni di lisi comunemente usate possono quasi inibire l'attività dell'RNasi.Pertanto, il punto chiave della scelta di una soluzione di lisi è da considerare in combinazione con il metodo di purificazione.C'è un'eccezione:si consiglia ai campioni con un elevato contenuto di enzimi endogeni di utilizzare un lisato contenente fenolo per aumentare la capacità di inattivare gli enzimi endogeni.
Scelta del metodo di purificazione
Fattori che influenzano le impurità endogene residue, la velocità di estrazione Per campioni puliti come le cellule, è possibile ottenere risultati soddisfacenti con quasi tutti i metodi di purificazione disponibili.Ma per molti altri campioni, soprattutto quelli con alti livelli di impurità come piante, fegato, batteri, ecc., la scelta di un metodo di purificazione adeguato è fondamentale.Il metodo di purificazione centrifuga della colonna ha una velocità di estrazione elevata e può rimuovere efficacemente le impurità che influenzano la successiva reazione enzimatica dell'RNA, ma è costoso (Foregene può offrire kit convenienti, maggiori dettagli fare clicQui);anche utilizzando metodi di purificazione economici e classici, come la precipitazione di LiCl, si possono ottenere risultati soddisfacenti, ma il tempo di operazione è lungo..
"Tre discipline e otto attenzioni" per l'estrazione dell'RNA
Disciplina 1:Porre fine alla contaminazione degli enzimi esogeni.
Nota 1:Indossare rigorosamente mascherine e guanti.
Nota 2:I tubi della centrifuga, le teste dei puntali, le aste delle pipette, i serbatoi per l'elettroforesi e i banchi sperimentali coinvolti nell'esperimento devono essere smaltiti accuratamente.
Nota 3:I reagenti/soluzioni coinvolti nell'esperimento, in particolare l'acqua, devono essere privi di RNasi.
Disciplina 2:Blocca l'attività degli enzimi endogeni
Nota 4:Scegliere un metodo di omogeneizzazione appropriato.
Nota 5:Scegli un lisato appropriato.
Nota 6:Controllare la quantità iniziale del campione.
Disciplina 3:Chiarire lo scopo dell'estrazione
Nota 7:Con qualsiasi sistema di lisato che si avvicina alla quantità massima iniziale di campione, il tasso di successo dell'estrazione diminuisce drasticamente.
Nota 8:L'unico criterio economico per il successo dell'estrazione dell'RNA è il successo negli esperimenti successivi, non la resa.
Le 10 principali fonti di contaminazione da RNasi
1. Le dita sono la prima fonte di enzimi esogeni, quindi i guanti devono essere indossati e sostituiti frequentemente.Inoltre, devono essere indossate anche maschere, perché anche la respirazione è un'importante fonte di enzimi.Un ulteriore vantaggio di indossare una maschera guanto è quello di proteggere lo sperimentatore.
2. Puntali per pipette, provette da centrifuga, pipette: l'RNasi non può essere inattivato mediante la sola sterilizzazione, pertanto i puntali delle pipette e le provette da centrifuga devono essere trattati con DEPC, anche se sono contrassegnati come trattati con DEPC.È meglio usare una pipetta speciale, pulirla con un batuffolo di cotone con alcool al 75% prima dell'uso, in particolare l'asta;inoltre, assicurati di non utilizzare un dispositivo di rimozione della testa.
3. L'acqua/il tampone deve essere privo di contaminazione da RNasi.
4. Almeno il tavolo di prova dovrebbe essere pulito con batuffoli di cotone con alcool al 75%.
5.RNasi endogena Tutti i tessuti contengono enzimi endogeni, quindi il congelamento rapido dei tessuti con azoto liquido è il modo migliore per ridurre la degradazione.Il metodo di stoccaggio/macinazione dell'azoto liquido è davvero scomodo, ma è l'unico modo per i tessuti con alti livelli di enzimi endogeni.
6. Campioni di RNA I prodotti di estrazione dell'RNA possono contenere tracce di contaminazione da RNasi.
7. Estrazione del plasmide L'estrazione del plasmide usa spesso la Rnasi per degradare l'RNA, e la Rnasi residua dovrebbe essere digerita con la Proteinasi K ed estratta mediante PCI.
8. Conservazione dell'RNA Anche se conservato a bassa temperatura, tracce di RNasi causano la degradazione dell'RNA.La migliore soluzione per la conservazione a lungo termine dell'RNA è una sospensione sale/alcool, perché l'alcol inibisce tutta l'attività enzimatica a basse temperature.
9. Quando i cationi (Ca, Mg) contengono questi ioni, il riscaldamento a 80°C per 5 minuti causerà la scissione dell'RNA, quindi se l'RNA deve essere riscaldato, la soluzione di conservazione deve contenere un agente chelante (citrato di sodio 1 mM, pH 6,4).
10. Gli enzimi utilizzati negli esperimenti successivi possono essere contaminati da RNasi.
10 consigli per l'estrazione dell'RNA
1: prevenire rapidamente l'attività RNase.I campioni vengono rapidamente congelati dopo la raccolta e l'RNasi viene inattivata mediante operazioni rapide durante la lisi.
2: Scegli un metodo di estrazione appropriato per il tessuto con alto contenuto di ribozima e il tessuto adiposo è meglio usare il metodo contenente fenolo.
3: La qualità della previsione richiede Northern, la costruzione della libreria cDNA richiede un'elevata integrità e RT-PCR e RPA (test di protezione della ribonucleasi) non richiedono un'elevata integrità.RT-PCR richiede un'elevata purezza (residui di inibitore enzimatico).
4: L'omogeneizzazione completa è la chiave per migliorare la resa e ridurre il degrado.
5: Verificare l'integrità del rilevamento dell'elettroforesi dell'RNA, 28S: 18S = 2: 1 è un segno completo, 1: 1 è anche accettabile per la maggior parte degli esperimenti.
6: Rimozione del DNA per RT-PCR, analisi dell'array È preferibile utilizzare Dnase I per rimuovere il DNA.
7: Ridurre la contaminazione degli enzimi esogeni – gli enzimi non possono essere importati dall'esterno.
8: Quando si concentra l'acido nucleico a bassa concentrazione, è necessario aggiungere un reagente di coprecipitazione.Ma per evitare che il co-precipitante contenente enzimi e la contaminazione del DNA.
9: Sciogliere bene l'RNA, se necessario scaldare a 65°C per 5 minuti.
metodo di conservazione adeguato
Può essere conservato a –20°C per un breve periodo e a –80°C per lungo tempo.Il primo passo per migliorare le rese di RNA è rendersi conto che il contenuto di RNA di diversi campioni varia notevolmente.Alta abbondanza (2-4ug/mg) come fegato, pancreas, cuore, media abbondanza (0,05-2ug/mg) come cervello, embrione, rene, polmone, timo, ovaio, bassa abbondanza (<0,05ug/mg) mg) come vescica, ossa, grasso.
1: Lisare le cellule per rilasciare RN – se l'RNA non viene rilasciato, la resa sarà ridotta.L'omogeneizzazione elettrica funziona meglio di altri metodi di omogeneizzazione, ma potrebbe anche essere necessario combinarla con altri metodi, come l'ammostamento dell'azoto liquido, la digestione enzimatica (lisozima/liticasi)
2: Ottimizzazione del metodo di estrazione.I maggiori problemi con i metodi a base di fenolo sono la stratificazione incompleta e la parziale perdita di RNA (il surnatante non può essere completamente rimosso).La stratificazione incompleta è dovuta all'elevato contenuto di acidi nucleici e proteine, che può essere risolto aumentando la quantità di lisato utilizzato o riducendo la quantità di campione.Una fase di estrazione del cloroformio è stata aggiunta al tessuto adiposo.La perdita di RNA può essere ridotta mediante pompaggio di ritorno o rimuovendo lo strato organico seguito da centrifugazione.Il problema più grande con i metodi basati sulla centrifugazione su colonna è il campione in eccesso.
Suggerimenti per l'estrazione classica
1. Purificazione del fenolo: aggiungere un volume uguale di fenolo/cloroformio 1:1 e mescolare vigorosamente per 1-2 minuti.Centrifugare ad alta velocità per 2 minuti.Rimuovere con attenzione il surnatante (80-90%).Non arrivare mai allo strato intermedio.Un volume uguale della soluzione di reazione può essere aggiunto a fenolo/cloroformio e il supernatante rimosso.I due supernatanti possono essere miscelati insieme per la precipitazione dell'acido nucleico per migliorare la resa.Non essere troppo gentile durante la miscelazione e non cercare di rimuovere tutto il surnatante.
2. Lavaggio con etanolo al 70-80%: durante il lavaggio, l'acido nucleico deve essere sospeso per garantire che il sale residuo venga lavato via.Allo stesso tempo, subito dopo aver tolto l'etanolo, centrifugare ad alta velocità per alcuni secondi, quindi rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta.Sciogliere dopo aver lasciato a temperatura ambiente per 5-10 minuti.
11. Estrazione di organizzazioni speciali
1. Tessuto fibroso: la chiave per l'estrazione dell'RNA dal tessuto fibroso come cuore/muscolo scheletrico è distruggere completamente il tessuto.Questi tessuti hanno una bassa densità cellulare, quindi la quantità di RNA per unità di peso del tessuto è bassa ed è meglio utilizzare quanta più quantità iniziale possibile.Assicurarsi di macinare accuratamente il tessuto in condizioni di congelamento.
2. Tessuti ad alto contenuto di proteine/grassi: il contenuto di grassi cerebrali/vegetali è elevato.Dopo l'estrazione PCI, il surnatante contiene fiocchi bianchi.Il surnatante deve essere riestratto con cloroformio.
3. Tessuti con alto contenuto di acido nucleico/ribozima: la milza/timo ha un alto contenuto di acido nucleico e ribozima.La macinazione del tessuto in condizioni di congelamento seguita da una rapida omogeneizzazione può inattivare efficacemente i ribozimi.Tuttavia, se il lisato è troppo viscoso (a causa dell'elevato contenuto di acido nucleico), l'estrazione PCI non sarà in grado di stratificarsi efficacemente;l'aggiunta di più lisato può risolvere questo problema.Più estrazioni PCI possono rimuovere più DNA residuo.Se subito dopo l'aggiunta di alcol si forma un precipitato bianco, indica una contaminazione da DNA.La riestrazione con PCI acido dopo la dissoluzione può rimuovere la contaminazione del DNA.
4. Tessuto vegetale: il tessuto vegetale è più complesso del tessuto animale.Generalmente, le piante vengono macinate in condizioni di azoto liquido, quindi la degradazione dell'RNA da parte di enzimi endogeni è rara.Se il problema del degrado non viene risolto, è quasi certamente causato dalle impurità contenute nel campione.Le impurità contenute in molte piante porteranno a residui, e la ragione dei residui è spesso perché queste impurità hanno alcune somiglianze con l'RNA: tu precipiti e io precipito, e tu adsorbi e io adsorbo.Queste caratteristiche determinano che sono inibitori enzimatici molto forti.
Attualmente, i reagenti commerciali per l'estrazione dell'RNA possono essere adattati a quasi tutti i tessuti animali con piccoli aggiustamenti, ma ci sono pochi reagenti commerciali per l'estrazione dell'RNA che possono essere adatti alla maggior parte dei tessuti vegetali.Fortunatamente, Foregene può fornire offerte specialikit di estrazione dell'RNA vegetale, abbiamoKit di isolamento dell'RNA totale della pianta, Kit di isolamento dell'RNA totale delle piante Plus.Quest'ultimo è appositamente progettato per piante ad alto contenuto di polisaccaridi e polifenoli.Per l'estrazione dell'RNA, il feedback degli utenti di laboratorio è particolarmente buono.
12. L'effetto del congelamento e dello scongelamento del campione Il campione congelato può essere più grande e deve essere tagliato prima di essere utilizzato per l'estrazione dell'RNA.I campioni tendono a sciogliersi (possibilmente parzialmente) durante il taglio.Potrebbe essere necessario pesare i campioni congelati prima dell'estrazione dell'RNA e durante questo processo si verificherà sicuramente lo scongelamento.A volte, lo scongelamento del campione avviene anche durante il processo di macinazione dell'azoto liquido;oppure il campione congelato viene aggiunto direttamente al lisato senza macinazione di azoto liquido e lo scongelamento avverrà sicuramente prima della completa omogeneizzazione.Gli esperimenti hanno dimostrato che il tessuto congelato è più soggetto alla degradazione dell'RNA durante lo scongelamento rispetto al tessuto fresco.La probabile ragione: il processo di congelamento-scongelamento interrompe le strutture all'interno della cellula, rendendo più facile per gli enzimi endogeni entrare in contatto diretto con l'RNA.
13. Valutazione della qualità dell'RNA Di solito, l'elettroforesi viene utilizzata per giudicare l'integrità dell'RNA e A260/A280 viene utilizzato per giudicare la purezza dell'RNA.In teoria, l'RNA intatto ha un rapporto di 28S:18S = 2,7:1 e la maggior parte dei dati enfatizza il rapporto di 28S:18S = 2:1.Il fatto è che quasi nessuno dell'RNA estratto da campioni diversi dalle cellule è in un rapporto 2:1 (questo è stato ottenuto utilizzando Agilent Bioanalyzer).
I risultati dell'elettroforesi dell'RNA sono influenzati da molti fattori, tra cui la struttura secondaria, le condizioni dell'elettroforesi, il carico del campione, il grado di saturazione di EB, ecc. Utilizzare l'elettroforesi nativa per rilevare l'RNA e utilizzare il marcatore del DNA come controllo.Se il 28S a 2kb e il 18S a 0,9kb sono chiari e 28S: 18S > 1, l'integrità può soddisfare i requisiti della maggior parte degli esperimenti successivi.
A260/A280 è un indicatore che ha causato molta confusione.Innanzitutto è necessario chiarire il significato originario di questo indicatore per gli acidi nucleici: RNA puro, suo A260/280 = circa 2.0.L'RNA puro è la "causa" e A260/A280 = 2 è l'"effetto".Ora tutti usano A260/A280 come 'causa', pensando che “se A260/A280 = 2, allora l'RNA è puro”, il che porta naturalmente a confusione.
Se sei interessato, puoi aggiungere un piccolo reagente che viene spesso utilizzato nell'estrazione, come fenolo, isotiocianato di guanidina, PEG, ecc., al tuo campione di RNA, quindi misurare il rapporto A260/A280.La realtà è che molti dei reagenti utilizzati per l'estrazione dell'RNA, così come molte impurità nel campione, assorbono intorno all'A260 e all'A280, influenzando l'A260/A280.
L'approccio più istruttivo al momento è scansionare campioni di RNA nell'intervallo 200-300 nm.La curva dell'RNA puro ha le seguenti caratteristiche: la curva è liscia, A230 e A260 sono due punti di flesso, A300 è vicino a 0, A260/A280 = circa 2,0 e A260/A230 = circa 2,0.Se i dati di scansione non sono disponibili, è necessario determinare anche il rapporto A260/A230, poiché questo rapporto è più sensibile al carryover di tutte le impurità che influenzano la reazione enzimatica.Tenere conto dell'intervallo lineare del dispositivo (0,1–0,5 per A260).
Ci sono altri due fenomeni utili: il rapporto sarà inferiore di circa 0,3 quando A260/A280 viene misurato in acqua;mentre il rapporto misurato in 10 mM EDTA è circa 0,2 superiore a quello misurato in 1 mM EDTA.
Prodotti correlati:
China Plant Total RNA Isolation Kit Produttore e fornitore |Foregene (foreivd.com)
Serie di isolamento dell'RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Tempo di pubblicazione: 15-lug-2022
